第一部分:JAK2V617F突变负荷量对Ph-MPN患者疾病影响的研究<br> 背景与目的:骨髓增殖性肿瘤(MPN)是指骨髓组织持续增殖而致造血干细胞的克隆性增生,以红系、粒系或巨核细胞增生为主。现所说的MPN主要是指费城染色体阴性(Ph-)的真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)。大部分MPN患者含有JAK2V617F突变,且JAK2V617F突变负荷量影响MPN患者的临床表现,如白细胞计数、脾脏大小、血栓等。本实验的目旨在观察JAK2V617F突变量对患者的临床表现及生存影响。<br> 方法:病例来源于2009.7~2011.12月期间在苏州大学附属第一医院就诊的MPN患者302例,采取患者的骨髓标本2ml,均使用肝素抗凝,淋巴细胞分离液分离单个核细胞,使用DNA抽提试剂盒抽提患者基因组DNA。利用等位基因特异性PCR方法扩增目的DNA,琼脂糖凝胶电泳筛选出176例JAK2V617F突变的标本,包括PV54例、ET116例、PMF6例。再通过实时定量PCR(RT-PCR)方法定量检测JAK2V617F突变负荷量,并通过测序方法检测PCR筛选的准确率。<br> 结果:54例PV患者JAK2V617F突变负荷量明显高于116例ET患者(33.2%VS6.8%)(P<0.05),6例PMF患者JAK2V617F突变负荷量高于116例ET患者(43.1%VS6.8%)(P<0.05),而PV与PMF两组间突变负荷量差异无统计学意义(P>0.05);PV组JAK2V617F突变负荷量>20%的患者比例高于ET组(68.5% VS26.7%)(P<0.05);全组MPN患者血栓和非血栓组JAK2V617F突变负荷量之间无统计学差异,但就ET患者而言,伴血栓形成组的JAK2V617F突变负荷量高于未发生血栓组(11.1%VS3.8%)(P<0.05);白细胞升高组(>10×109/L)患者JAK2V617F突变负荷量高于未升高组(P<0.05),血红蛋白浓度升高(>150g/L)及高龄(>60岁)患者JAK2V617F突变负荷量高于对照组(P<0.05),34例脾肿大患者基因突变负荷量高于56例脾脏未肿大组(P<0.05),然而JAK2V617F突变负荷量与血小板计数呈负相关(P<0.05);性别与基因突变量之间无相关性(P>0.05)。经单因素分析JAK2V617F突变量对生存率无统计学影响,多因素分析白细胞计数、年龄、性别及脾肿大对生存率无影响(P>0.05)。<br> 结论:PV及PMF患者JAK2V617F突变负荷量高于ET患者,而PV与PMF之间基因突变负荷量无明显差异;JAK2V617F突变负荷量影响MPN患者的临床表现:如白细胞数、血红蛋白浓度及脾脏大小,高龄(>60岁)患者JAK2V617F突变负荷量增加;伴血栓形成ET的患者,其JAK2V617F突变负荷量增高。<br> 第二部分:Ph-MPN患者微颗粒测定及其与JAK2V617F突变关系的研究<br> 背景与目的:微颗粒(MPs)是由细胞膜脱落形成,直径在0.1-0.8μm,已证实MPs在循环促凝中起重要作用,尤其是组织因子微颗粒(TF MPs)。血小板微颗粒(PMPs)的促凝活性远高于血小板的止血能力,红细胞微颗粒(RMPs)具有极强的刺激凝血酶产生能力,在多种疾病中可激发血栓形成。内皮细胞微颗粒(EMPs)是内皮损伤的标志,激活内皮细胞,可诱导微颗粒的释放。MPN患者常伴发血栓出血表现,有报道显示ET患者血循环中MPs明显升高,TF MPs水平与JAK2V617F突变有相关性。因此,本实验的目的是检测MPN患者血浆中的MPs水平状况,及其与JAK2V617F突变的关系。由于MPN患者常表现为红细胞及血小板升高,因此本实验共检测了四种MPs,分别为RMPs、PMPs、TF MPs及EMPs。<br> 方法:采用流式细胞术(FCM)检测微颗粒:抽取67例MPN患者空腹静脉血,包括PV12例、ET49例、PMF6例,枸橼酸钠抗凝(1:9),以藻红蛋白标记特异性荧光抗体 CD235a(CD235a-PE)、CD61(CD61-PE)、CD142(CD142-PE)和 CD62E(CD62E-PE)分别标记红细胞、血小板、组织因子(TF)和内皮细胞,检测的MPs分别为RMPs、PMPs、TF MPs及EMPs,0.8μm的标准微球设定前向检测区,界定直径大小在0-0.8μm之间,FCM检测这四种微颗粒的绝对计数。<br> 结果:所检测的四种MPs水平均采用中位数(M)和四分位区间(IQR)表示。(1)实验组与正常对照组:67例MPN患者MPs水平均高于34例正常对照,RMPs49.0/μl(15.8-109.5/μl):21.0/μl(13.8-32.6/μl)、PMPs181.2/μl(75.8-1111.6/μl):74.9/μl(55.5-115.4/μl)、TF MPs48.1/μl(13.1-72.4/μl):31.0/μl(14.9-47.6/μl)、EMPs310.2/μl(128.6-1130.5/μl):155.9/μl(100.3-227.6/μl)(P<0.05);(2)MPN不同亚型间的MPs水平:PMF患者PMPs水平高于PV及ET患者(P<0.05),但在PV与ET患者之间无明显区别,同时另外三种MPs在三种亚型间无明显区别(P>0.05);(3)MPs与JAK2V617F突变的关系:34例JAK2V617F突变组TF MPs和RMPs明显高于未突变组,具体为56.0/μ(17.9-122.1/μL):16.6/μl(11.6-47.3/μL)、65.6/μl(23.0-189.0/μL):26.9/μl(11.7-74.4/μL)(P<0.05),另外两种MPs在两组间无明显区别(P>0.05)。(4)MPs在不同并发症中的水平:a.10例血栓组患者MPs水平高于31例非血栓组:RMPs78.7/μl(63.2-182.4/μl):23.1/μl(11.2-76.1/μl)、PMPs569.9/μl(222.6-2275.0/μl):111.8/μl(59.1-570.4/μl)、TF MPs87.8/μl(58.5-129.0/μl):16.4/μl(11.0-62.0/μl)、EMPs974.1/μl(206.4-1323.1/μl):265.1/μl(102.6-513.0/μl)(P<0.05);b.19例伴脾肿大组患者MPs高于14例非肿大组:RMPs91.5/μl(51.4-195.3/μl):25.5/μl(16.7-74.4/μl)、PMPs774.8/μl(201.8-3069.1/μl):174.8/μl(79.9-209.5/μl)、TF MPs85.6/μl(45.7-156.6/μl):14.1/μl(11.6-65.8/μl)、EMPs1174.5/μl(361.1-3491.2/μl):307.6/μl(146.1-608.5/μl)(P<0.05);<br> 结论:所检测的四种MPs水平:MPN患者实验组高于正常对照组,血栓组高于非血栓组,脾肿大组高于非脾肿大组。JAK2V617F阳性组患者TF MPs和RMPs高于对照未突变组,而另两种MPs水平在两组之间无明显区别。 |
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