【原】三体-复合物，调控细胞抗化疗

作者：Luck King

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七夕快到了，撒把狗粮。分子伴侣调控抗化疗机制。至于标题翻译，怎么都觉得拗口，欢迎大、小牛们留言赐教。

热休克蛋白（HSP）表达谱的改变与癌症患者（TP53突变、MDM2过表达）的较低存活率相符（表型：生存曲线和基因关系，其实可以跳过了…）

患者TP53的突变（mut TP53）显示出较差的总体存活率、乳腺癌特异性存活率。作者提出TP53突变、TP53杂合度丢失（LOH）和MDM2过表达对死亡率的有综合影响。从UCSC获得TCGA PANCAN12数据库，分析数据库中存在的12种不同癌症亚型患者的生存率与TP53状态、MDM2表达水平的相关性。Kaplan-Meier生存曲线表明癌症患者的最佳预后与WT TP53、低MDM2相关（图1A）。

单独TP53的突变（MUT TP53），或者一定程度上单独MDM2过表达（高MDM2），会导致存活率的降低。研究的癌症患者中约有10％，是TP53突变和高MDM2同时发生，其存活率显著降低，尤其是在癌症发展的早期阶段（图1A）。

重要的是，较低存活率的患者（mut TP53/高MDM2）与TP53杂合性丧失（LOH）相关（附图1A），这表明观察到的表型是mut TP53功能获得（GOF）性的。

此外，当TP53状态、其表达水平以及与MDM2表达水平相结合时，观察到生存率更加显著降低（图1B）。在这种情况下观察到TP53 LOH杂合性丧失（补充图1B）。这一观察结果清楚地表明，mut P53的功能获得性（GOF）不仅取决于其体细胞基因突变，而且还取决于癌细胞中的表达丰度。

在来自TCGA PANCAN12数据库中，乳腺癌（BRCA）情况如下，近8％（59例）的患者表现出TP53突变以及MDM2过表达。为BRCA患者绘制的Kaplan-Meier生存曲线再次表明，乳腺癌预后最差的患者，同时发生TP53突变和MDM2过表达（mut TP53/高MDM2）（图1C）。

数据挖掘实验旨在预测表型与热休克蛋白DNAJB1/HSP40水平之间潜在的相关性。换句话说，乳腺癌患者中DNAJB1/HSP40的高表达者表现出较差的存活率，其依赖于TP53突变&MDM2过表达（MUT TP53/高MDM2）（图1D）。

对于DNAJB1/HSP40表达低水平的的患者，其不良预后与TP53突变&MDM2表达水平（Mut TP53/高MDM2亚组）不具有相关性（图1E）。

因此，提出假设：DNAJB1/HSP40对于HSP70是良好的特异性因子，负责吸引特定蛋白质亚基。DNAJB1/HSP40可能参与降低mut TP53/high MDM2乳腺癌患者的存活过程。Mut TP53/高MDM2乳腺癌患者的生存率差不仅与DNAJB1/HSP40分子伴侣的高表达水平相关，而且与DNAJ家族其他成员即DNAJB6的高表达相关。

对分子伴侣家族生信分析，依据与存活率相关性进行筛选，排除大多数、保留少数进行后续试验。（具体见表1）

肺腺癌（LUAD）组，在TCGA PANCAN12数据库中，关于TP53状态、MDM2表达的病例较少（n=150）。尽管如此，与其他患者相比，同时具有TP53突变和MDM2表达水平升高的患者（21例，14％）存活率呈下降趋势，但没有统计学意义（图1F）。鉴于数量有限，不进行下一步的生存分析。

大多数乳腺癌患者和肺癌患者至少有一个化疗周期。在NSCLC，63％和75％的患者分别对顺铂和多柔比星具有抗药性。在乳腺癌，化疗周期被认为是导致癌症肿瘤内异质性（ITH）的促进剂，并且会促进癌细胞高度耐药性。

考虑到这一点，作者假设具有TP53突变和MDM2过表达（突变TP53/高MDM2）的患者可以更加有效地获得化学耐药性，从而降低其对经典化疗的反应机会。

因此，作者着手研究细胞水平，TP53突变状态与MDM2升高之间的相互作用及其对化疗耐药性的联合作用。（引子，好长）

癌细胞的抗化疗性与p53状态、TAp73α的螯合、化疗类型等相关

培养的P53突变体细胞对抗化疗具有不同反应。选择不同的癌细胞系模型（乳腺癌MCF7、SKBR3和非小细胞肺癌-H1299）进行实验。

对照实验中显示：与WT p53相比，构象突变体（p53 R175H）和接触突变体（p53 R273H）可以更有效地促进应对DNA损伤的化疗抗性（补充图2和3）。

TAp63和TAp73的螯合机制显示出：依赖于与肿瘤来源的mut p53s形成稳定复合物。为了进一步研究TAp63和TAp73与11种不同突变形式的p53的结合亲和力，p53野生型（WT）、mut p53转染H1299细胞系（构建质粒，转染细胞），然后与TAp63α、TAp73α进行免疫共沉淀。

发现，没有构象变化的WT p53、mut p53（接触突变体）与TAp63α、TAp73α表现出弱相互作用（WT p53、R248Q、D248W、R175A、R273H图中绿点）。而，mut p53构象变化的突变体(R175H、G245S、R249S、D281G、R282W、R158L、Y220C、V143A图中红点)与 TAp63α、TAp73α形成稳定复合物（Fig.2A,2B）。

在37℃细胞中表达的WT p53蛋白与TAp73α、TAp63α没有相互作用（图2A，2B）。然而，当细胞暴露于热休克（42℃，1小时）状态下，p53构象发生改变，p53与TAp63α、TAp73α的结合显著增加（图2C）。已知部分解折叠、蛋白变性，包括p53构象改变突变体或者WT p53蛋白部分未折叠可被热激蛋白识别。这表明热休克蛋白可以影响具有构象改变的p53与TAp73α、TAp63α形成复合物。

作者前期工作表明：在ATP依赖性反应中，HSPA1A/HSP70在癌细胞中过表达可以解离p53R175H-TAp63α，但不能解离p53 R175H-TAp73α复合物。通过HSP70依赖性反应，释放TAp63α能够从BAX启动子启动基因转录。与TAp63α相反，TAp73α与p53 R175H的复合物在HSPA1A/HSP70存在下不能解离，并且TAp73α的转录活性保持抑制。鉴于此，作者希望研究热休克蛋白在形成p53 R175H-TAp73α复合物中的作用。

HSP促进TAp73α和结构突变体p53结合，从而增加癌细胞抗化疗

连续进行两次免疫共沉淀实验表明：HSPA1A/HSP70可以同时与p53 R175H和TAp73α相互作用（图3A）。

除了HSP70外，内源性分子伴侣DNAJB1/HSP40、HSP90A/HSP90与蛋白复合物p53 R175H-TAp73α免疫共沉淀。此外，还检测到HSPA8/HSC70与p53 R175H-TAp73α复合物结合。（图3B）。

为了进一步研究HSPA1A/HSP70在p53 R175H-TAp73α复合物形成中的作用，作者使用三种形式的HSPA1A/HSP70，代表不同的核苷酸状态与热休克蛋白结合，即HSP70 WT、HSP70 K71S和HSP70 D10S。HSP70 WT具有ATP酶活性；HSP70 K71S不具有ATPase活性，因此主要以ADP结合形式存在；而HSP70 D10S对ATP、ADP亲和力均非常低，因此不呈现任何ATP酶活性。已知，ADP的稳定性是基于底物-HSP70复合体形式。

两种ATPase死亡变体都表现出对HSP70 WT的显性负调控模式。H1299细胞中三种HSP70突变体的过表达（HA-HSP70 WT、K71S、D10S分别异常表达），导致HSP70 WT组中的p53 R175H-TAp73α复合物稳定，K71S组中的稳定性更强，但是诱导HSP70 D10S中复合物不稳定（图3C上）。此外，研究了TAp73α与HSP70突变体的相互作用（图3C下）。

HSP70 WT、HSP70-ADP结合形式（HSP70 K71S）与TAp73α相互作用，但在HSP70核苷酸游离形式（HSP70 D10S）下，与TAp73α的相互作用被消除。

此外，在H1299细胞模型中，HSP70 D10S的过表达抑制了依赖p53 R175H的细胞凋亡，其中p53 R175H的表达由PonA诱导（图3D，对照另见补充图3A）。因此，表明：HSPA1A/HSP70积极参与p53 R175H-TAp73α复合物的形成。

相对于DNAJB1/HSP40，癌症患者p53突变、MDM2升高（mut TP53/ high MDM2） 后其存活率显著降低。（图 1D ）

因此，该分子伴侣可能参与形成特异性蛋白质-蛋白质复合物，导致TAp73α肿瘤抑制因子的螯合。验证这一假设，通过特异性siRNA敲除内源性DNAJB1/HSP40，结果使p53 R175H-TAp73α复合物部分解离（图 3E ，3F ）。

这些结果突出了分子伴侣的重要性，即HSPA1A/HSP70和DNAJB1/HSP40促进p53 R175H-TAp73α复合物的形成。

此外，其他几种分子伴侣如HSP90A/HSP90或HSPA8/HSC70也用该复合物免疫沉淀（图 3B ），表明存在参与TAp73α螯合伴侣蛋白网络，从而允许癌细胞在化学治疗剂存在条件下存活。

MDM2诱导形成mut p53-TAp73α-MDM2复合体，增强癌细胞的抗化疗性

乳腺癌和肺癌患者，MDM2表达升高与TP53（突变TP53/高MDM2）改变一致，在化疗后显示出较低的存活率，与TP53突变或者MDM2过表达的患者相比（图1）。

考虑到HSP70-HSP40伴侣在p53 R175H-TAp73α复合物形成中的主动作用，研究MDM2细胞流入对TAp73α螯合的潜在影响，以及分子伴侣在该过程中的作用。

在H1299肺癌细胞中，MDM2异常表达以剂量依赖性方式从p53R175H-TAp73α复合物释放HSPA1A/HSP70和DNAJB1/HSP40，从而导致形成p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物（图4A）。

此外，在MDM2过剩条件下，添加已知的MDM2抑制剂Nutlin-3，扭转了反应：MDM2从p53 R175H-TAp73α复合物中释放，内源性HSPA1A/HSP70和DNAJB1/HSP40反回到p53 R175H-TAp73α复合物（图4A）。

为了检验MDM2同时与p53和TAp73α相互作用，采用两步Co-IP方法。在MDM2升高的条件下，形成了包含p53 R175H-TAp73α-MDM2的稳定三体复合物（图4B）。

在乳腺癌SKBR3细胞系中观察到类似的复合物，内源性p53 R175H（图4C左）。

在对照实验中，内源性的p53 R175H同时与内源性TAp73α、MDM2形成三体复合物（图4C右图）。

由内源性蛋白质组成的p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物对Nutlin-3浓度的增加很敏感（图4D）。在Nutlin-3低浓度时，复合物中几乎检测不到MDM2、TAp73α。然而，Nutlin-3浓度的进一步增加导致与p53 R175H复合物中出现HSP40和TAp73α。

这些结果表明：Nutlin-3的存在将p53 R175H-TAp73α-MDM2三体复合物的平衡转移到R175H-TAp73α二体结构，并且其形成受到分子伴侣存在的刺激（图4D左图）。

值得注意的是，在细胞裂解物中，增加Nutlin-3的浓度降低了p53 R175H和TAp73α的总量（图4D右图）。之前研究显示，Nutlin-3通过降低p53 R175H的稳定性来破坏p53 R175H-多分子伴侣复合物。Nutlin-3存在下mut p53的稳定性降低，与其相似，TAp73α的丰度也受到影响。

这使得IP结果的解释更加困难，但也可以开启一种调查分子伴侣在TAp73α稳定性、随后将TAp73α转化为不同p73形式的作用的新途径。

为了阐明，导致突变型p53和MDM2水平升高时螯合TAp73α肿瘤抑制因子活性的分子机制，作者构建了具有MDM2、p53 R175H诱导表达的稳定细胞系H1299（图5A）。

使用xCELLigence系统测量这些细胞对化疗反应的实时增殖指数（图5B）。顺铂处理，与诱导仅表达结构突的p53 R175H细胞比对，未诱导的细胞对顺铂更具抗性。此外，单独的MDM2过表达促进了化学耐药性升高。然而，在p53R175H和MDM2同时表达的情况下，对顺铂的化学抗性是显性的（图5B），表明讨论的这两种蛋白质具有协同作用模式。

与细胞毒性测定一致，诱导MDM2或p53 R175H后在一定程度上抑制了依托泊苷/顺铂诱导的癌细胞凋亡（图5C）。当MDM2和p53 R175H都过表达时，这些作用显著增加。该数据表明p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物的形成可以额外降低细胞凋亡反应，从而增加化学耐药性（图5C）。

SIMP6肽（抑制剂）的存在抑制p53 R175H-TAp73α复合物形成（补充图4A），不能从p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物中释放出TAp73α（附图6）。

因此，可以认为形成p53 R175H-TAp73α复合物的蛋白质的构象与形成三体p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物的成分的构象不同。另一方面，MDM2对这种三体癌蛋白具有高亲和力，可以作为p53 R175H和TAp73α复合体内的支架稳定器。

在SKBR3细胞系内形成的内源性p53 R175H-TAp73α-MDM2复合物，Nutlin-3抑制MDM2从三体复合体解离（图4D），与DOXO诱导的细胞凋亡相比，统计学表明显著增加（图5D）。

因此，通过抑制MDM2可部分挽救内源性肿瘤抑制因子TAp73α促细胞凋亡。在对照实验中，将SKBR3 sh-p53细胞内源性p53 R175H的表达降低后，发现Nutlin-3对其凋亡没有任何影响（图5D）。

此外，DOXO诱导SKBR3 p53 WT细胞的凋亡特征（稳定敲除p53 R175H，p53 WT的组成型表达）显示：Nutlin-3作为p53反应途径的规范催化剂，增强MDM2反式抑制（图5D）。

经Nutlin-3处理，同时通过特异性siRNA抑制HSP40，将促进DOXO诱导的细胞凋亡（图5E）。

这表明：类似于H1299细胞，在SKBR3背景下，由p53 R175H组成的多蛋白复合物的形成过程中，MDM2可有效地螯合TAp73α。此外，MDM2抑制剂和分子伴侣抑制剂同时存在可以刺激该多蛋白复合物的部分解离，从而使癌细胞药物依赖性凋亡。

总结一句话，就是谁和谁在一起了，谁和谁又不在一起了。（如上图）

挑文献读文献，我通常分两种：

1、有目的性去读某个方面好多paper；

2、无目的性的，挑不熟悉的方向方法，用于扩充知识面。

本文属于2，然后真就二了。细读下来，第一个吐槽点就是补充图太多，都到Supplementary Figure 6。差评、差评、差评~！严重影响阅读流畅性。

亮点两步法免疫共沉淀，检测相互作用。但这一步，是否可以用酵母双杂交或者双分子荧光互补进行？且后者出的confocal图，会提升逼格。