【原】【雷说新药】突破乙肝治愈困境的生力军——RNA疗法

 乙肝流行情况 

乙型肝炎是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人体肝脏引起的急性或慢性肝病。当人体的免疫系统不能消灭HBV，导致其在血液和肝脏中持续存在，则形成慢性HBV感染，其中较大一部分表现为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)，通常简称为“慢乙肝”。

随着HBV疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的普及，HBV感染的预防取得了显著成果，从1980年代至2015年，5岁以下儿童新发感染率从4.7%降到了1.3%，但是存量患者群体仍然非常庞大。根据世界卫生组织(WHO)发布的2017年全球肝炎报告，2015年全球约有2.57亿慢性HBV感染者，当年新确诊的感染者有2200万人，其中仅有170万(8%)得到治疗。全球每年近90万人死于慢性HBV感染进展的疾病，包括肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌。

据中国肝炎防治基金会估算，2020年我国乙肝病毒感染者约7000万人，需要治疗的约2000多万，能够接受规范治疗的只有11%。中国肝癌的死亡顺位由1990年的11位上升到2017年的第7位，肝癌患者中86%感染了乙肝病毒，6.7%为乙肝病毒和丙肝病毒合并感染。慢性HBV感染在全球范围内巨大的患者群体和较低诊疗率，意味着巨大的市场空间。

图表1. 2015年全球慢性HBV感染者地区分布

来源：世界卫生组织、中康产业资本研究中心

 乙肝病毒生命周期 

HBV是一种独特的嗜肝DNA病毒，通过与肝细胞膜上受体，如钠离子-牛磺酸协同转运蛋白(NTCP)相互作用，去除乙肝表面抗原(HBsAg)包膜蛋白和磷脂包膜。剩余的核心颗粒进入肝细胞，再脱除核衣壳，即乙肝核心抗原(HBcAg)，将松弛环状的双链DNA(RC DNA)运输至细胞核内。在HBV DNA聚合酶的作用下，RC DNA的缺口被补齐，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。以cccDNA为模板，转录产生前基因组RNA(pgRNA)和其他3种mRNA(preSRNA、SRNA、XRNA)，这些RNA翻译得到聚合酶(Pol)、HBc蛋白、pre-core蛋白、表面蛋白(S、LS、MS)和HBx蛋白。前基因组RNA出核后，在逆转录酶和聚合酶的作用下形成RC DNA，与核衣壳蛋白(HBc)组装成核心颗粒。核心颗粒可再次进入细胞核补充cccDNA，或者在内质网(ER)组装成完整的病毒粒子，以出芽的方式脱离细胞，再去感染邻近的肝细胞。

此外，pre-core蛋白可以经过蛋白水解，在内质网内形成乙肝e抗原(HBeAg)，3种表面蛋白(S、LS、MS)则在内质网形成乙肝表面抗原(HBsAg)。HBeAg和HBsAg这两种蛋白可以分泌到细胞外，而不必组装成完整的病毒粒子。受感染肝脏细胞释放的大量HBsAg会导致T细胞耗竭，产生免疫抑制效果，在维持HBV感染的持久性中起重要作用。

图表2. 乙肝病毒生命周期及相关疗法

来源：公开信息、中康产业资本研究中心

 慢乙肝的治愈类型 

慢乙肝治愈的类型包括完全治愈(病毒学治愈)和临床治愈(功能性治愈/免疫学治愈)。完全治愈(病毒学治愈)即血清HBsAg检测不到，肝内和血清HBVDNA清除(包括肝内cccDNA和整合HBV DNA)，血清抗-HBc持续阳性，伴或不伴抗-HBs出现。HBV cccDNA可在肝细胞核内形成微染色体，具有高度稳定性，无需新的病毒进入肝细胞即可自我补充(图表2中3-4-5-7-8-9-3的循环)。此外，HBV可以将双链线性DNA整合到宿主DNA中，整合的基因组片段不能表达核心蛋白，但可以持续表达HBsAg。独特复杂的基因组和复制模式使HBV难以从体内彻底清除。

临床治愈(功能性治愈/免疫学治愈)指完成有限疗程治疗后，血清HBsAg和HBV DNA持续检测不到，HBeAg阴转，伴或不伴HBsAg血清学转换(指HBsAg转阴且抗-HBs转阳)，残留cccDNA可持续存在，肝脏炎症缓解和肝组织病理学改善，终末期肝病发生率显著降低。

图表3. 慢乙肝的完全治愈和临床治愈

来源：2019慢乙肝临床治愈专家共识、中康产业资本研究中心

 现有疗法的局限 

慢乙肝目前已批准的疗法包括直接作用于HBV生命周期中逆转录和DNA合成环节(图表2中8-9)的直接抗病毒药物(DAA)，即核苷(酸)类似物(NA)，以及免疫调节剂干扰素(IFN)类。

NA可强效抑制HBV复制，但不能直接抑制cccDNA的转录活性(图表2中4)，从而无法有效抑制各种病毒蛋白如HBsAg的表达。长期治疗后，cccDNA和HBsAg水平会逐渐下降，但HBsAg的阴转率仅有0~3%，如果不转阴则意味着未达到临床治愈。最严重的是，NA停药后HBV会迅速复制，这意味着患者需要长期甚至终身用药。

图表4. 全球用于乙肝治疗的已上市的核苷(酸)类似物

来源：公开信息，中康产业资本研究中心

干扰素中具有抗乙肝病毒作用的为干扰素α(IFNα-2a、IFNα-2b)，以及长效的聚乙二醇化干扰素α(PEG-IFNα-2a、PEG-IFNα-2b)。干扰素通过增强免疫细胞功能、促进细胞因子表达、诱导并编码多种抗病毒蛋白等作用于HBV的复制、转录等过程，发挥免疫调节和抗病毒的双重作用。干扰素可以增强HBV前基因组RNA(pgRNA)和核心颗粒的降解，抑制cccDNA的转录，从而减少病毒蛋白如HBsAg的表达。相比NA，干扰素单独使用疗程有限，效果稍好，如PEG-IFN单药治疗HBsAg阴转率为3%~7%。然而，干扰素仅对部分患者有效，且耐受性较差。核苷(酸)类似物和干扰素除了单独使用，也在被探索联合疗法，但最佳联用策略，如具体药物选择、剂量、疗程、同时给药、序贯治疗等，目前尚未确立。

慢乙肝现有疗法能够在一定程度上抑制HBV，部分逆转炎症和纤维化，能够降低但不能消除肝细胞癌风险。现有疗法的主要局限是对HBsAg清除率低，不能实现临床治愈，更不能根除cccDNA和整合DNA实现完全治愈。慢乙肝现有疗法的局限意味着巨大的未被满足的临床需求，因此全球许多制药企业和研发机构都在努力探索能够提供临床治愈甚至完全治愈的创新疗法。

 慢乙肝的在研创新疗法 

治疗慢乙肝的方向可以分为直接抗病毒药和免疫调节剂，前者针对病毒生命周期各环节，后者则针对人体的免疫系统(图表5)。目前针对HBV复制周期的各环节，均有一些在研创新疗法，包括病毒进入抑制剂、cccDNA切割、转录抑制剂、聚合酶抑制剂、衣壳阻滞剂和释放抑制剂。免疫调节剂包括针对先天性免疫的Toll样受体(TLR)小分子激动剂和PD-1单抗，针对适应性免疫的治疗性疫苗和工程化T细胞。现有的核苷(酸)类似物(NA)疗法多为逆转录抑制剂，针对此机制的在研创新疗法较少。

图表5. 全球用于乙肝治疗的创新疗法(部分)

来源：公开信息，中康产业资本研究中心

在创新疗法中，进入抑制剂(entry inhibitors)只能用于预防病毒感染，对于已进展为慢性感染的患者则无法发挥治疗作用，而且对于HBV进入肝细胞的具体机制目前并不完全清楚，开发风险较大。直接针对cccDNA的基因编辑寻求慢乙肝完全治愈，但是可能存在伦理和脱靶引起的安全性问题。免疫调节剂主要是生物制品，开发难度较大，已有众多治疗性疫苗失败。

聚合酶抑制剂、衣壳阻滞剂和释放抑制剂，相对于转录抑制剂处于HBV复制周期的下游，并不能直接阻止病毒各种蛋白如HBsAg的表达。HBsAg阴转是慢乙肝临床治愈的重要目标，因此直接影响cccDNA转录和翻译(图表2中4-5)的转录抑制剂在作用机制上可能具有一定优势，目前较多的在研疗法也印证了这一点(图表5)。HBV转录抑制剂大多是基于RNA干扰(RNAi)机制的疗法，属于RNA疗法。

RNAi(RNA interference，RNA干扰)的机制是长双链RNA(dsRNA)或短发卡结构RNA(hairpin RNA)被核酸内切酶Dicer剪切为siRNA，再与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，在解旋酶作用下脱去正义链，带有反义链的RISC再与特定mRNA特异互补，降解mRNA或抑制其翻译，达到静默特定基因表达的效果(图表6)。由于RNAi技术可以特异性静默特定基因的表达，被积极用于开发针对罕见病、癌症、病毒性疾病等的基因疗法。

图表6. RNAi的基本作用机制示意

来源：Asian J. Pharm.、中康产业资本研究中心

 RNA疗法 

RNA疗法的机理是使用能够与mRNA通过碱基配对结合的寡核苷酸来影响mRNA的代谢。这些过程包括从mRNA前体(pre-mRNA)开始的mRNA剪接和成熟过程、mRNA的运送、mRNA的蛋白转译，以及mRNA的降解。目前RNA疗法主要包括ASO(反义寡核苷酸)、siRNA(小干扰RNA)和miRNA(小分子RNA)(图表7)。

图表7. RNA疗法中三类药物的比较

来源：公开信息、广证恒生、中康产业资本研究中心

ASO药物发现最早，获批药物较多。1998年FDA批准了首个ASO药物，Ionis公司的Vitravene(fomivirsen)，用于二线治疗艾滋病人并发的CMV(巨细胞病毒)视网膜炎。2016年，Biogen/Ionis的ASO药物Spinraza(nusinersen)获批，成为首款治疗儿童和成人脊髓型肌萎缩症(SMA)的疗法。2018年，Ionis公司的Tegsedi(inotersen)获批，成为首款治疗遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性(hATTR)的疗法。

ASO药物是可以直接与靶标mRNA相结合的单链寡核苷酸，亲水性比双链寡核苷酸弱，通过磷硫酰化提高稳定性，增强与蛋白质的结合和组织扩散的能力。与ASO药物不同，siRNA药物是双链寡核苷酸，亲水性强，在组织中扩散和被细胞吸收的效果都不好。对于双链寡核苷酸的修饰主要有两种方法，一种使用脂质纳米颗粒帮助运送到靶点组织(主要是肝细胞)并保护核苷酸不被降解，另一种使用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修饰促进siRNA被肝细胞靶向吸收。由此可见，siRNA药物的修饰方法带来的肝脏靶向性有利于研发治疗慢乙肝的创新疗法。

2018年FDA批准了全球首个siRNA药物，Alnylam公司的Onpattro(patisiran)，也是首款用于治疗成年患者由hATTR引起的多发性神经病的疗法。2019年11月，Alnylam公司的又一款siRNA药物Givlaari(givosiran)获得FDA批准，用于治疗患有急性肝卟啉症(AHP)的成年患者。随着药物递送问题的突破，siRNA药物将逐渐成为主流的RNA疗法。miRNA只需要2-8位核苷酸配对就能发挥作用，通常作用于一个协同的网络而非单条通路，相关技术还需要继续研究。

 慢乙肝的在研RNA疗法介绍 

针对慢乙肝的siRNA药物主要靶向乙肝病毒的前基因组RNA(pgRNA)和3种mRNA(图表2中4)，而ASO药物通过与病毒mRNA结合阻止其翻译为病毒蛋白从而抑制病毒复制。近年来有多款siRNA药物和ASO药物进入临床试验阶段，寻求慢乙肝的临床治愈(功能性治愈/免疫学治愈)。

2020年8月27日-29日(中欧夏季时间)，欧洲肝病研究学会(EASL)组织的2020年国际肝病年会(ILC 2020)在线上召开。EASL是世界权威的肝病研究学会，其组织召开的ILC是全球肝脏病学领域最具影响力的国际会议之一。ILC展示肝病领域最佳临床实践和科学，介绍肝病学的最新趋势，呈现科学前沿进展。ILC2020 公布了全球范围内慢乙肝RNA疗法的最新进展，下面择要介绍。

 JNJ-3989 

杨森(Janssen)与RNA疗法公司Arrowhead于2018年10月签订协议，合作开发和商业化siRNA药物JNJ-3989(ARO HBV)。ILC 2020公布了JNJ-3989与核苷(酸)类似物(NA)联用治疗慢乙肝1/2期研究(AROHBV1001)的2期临床数据。数据分析的目的是评估研究从开始到结束(第392天，服用最后一剂JNJ-3989的48周后)，HBsAg、HBV RNA、HBeAg和乙肝核心相关抗原(HBcrAg)的持续应答。持久应答者定义为从第0天-第392天持续表现为HBsAg下降≥1log₁₀IU/mL(1个指数单位)的慢乙肝患者。

图表8. siRNA药物JNJ-3989+NA联合疗法作用机制示意

来源：Janssen、中康产业资本研究中心

分析结果显示：97.5%的患者接受治疗后HBsAg水平降低1个指数单位以上，并且在最后一剂JNJ-3989给药后48周内，39%(15/38)的患者表现为持久应答；(2)HBV RNA、HBeAg、HBcrAg的降低在所有队列都可见，且在HBsAg持久应答者中更明显；(3)JNJ-3898的试验剂量显示出良好的耐受性，似乎具有良好的长期安全性。分析结果支持对JNJ-3989+NA联合疗法进行更长时间的评估，目的是实现慢乙肝的功能性治愈。

 GSK3228836 

2019年，葛兰素史克(GSK)以高达2.62亿美元的里程碑付款和相应的销售分成，从专注于开发反义寡核苷酸(ASO)药物的Ionis公司获得了两款乙肝在研疗法的研发和推广权益，其中一款为GSK3228836(GSK836，ISIS 505358)。该药是针对所有HBV RNA的2'-MOE(甲氧基乙基)修饰的反义寡核苷酸，通过核糖核酸酶H1诱导细胞核和细胞质中HBV RNA的切割。

ICL 2020公布了GSK836的临床2a期试验数据，包括未经治和接受稳定核苷(酸)类似物(NA)稳定治疗≥12个月的慢乙肝患者，在第1、4、8、11、15和22天皮下注射GSK836(300mg)或安慰剂。对HBV影响的主要评估在第29天进行，随后进行为期6个月的随访，观察GSK836能否持续显著降低HBsAg和HBV DNA低于定量检测下限。

结果显示，对于NA经治的患者，接受GSK836治疗的4例患者中有3例的HBsAg降幅超过3个指数单位，其中1例低于检测下限，另有1例患者在第36天低于检测下限。对于NA未经治患者，接受GSK836治疗的12例患者中有3例的HBsAg降幅超过3个指数单位对于6位接受GSK836治疗的患者HBsAg水平下降3个指数单位以上，其中2例低于检测下限(图表9)。对于接受GSK836治疗的16例患者，其中4例的HBsAg水平降到检测下限之下，可视为实现了功能性治愈，治愈率25%。GSK计划年底开始GSK836的2b期临床试验。

图表9. 第29天检测到患者的HBsAg水平变化

来源：ICL 2020、中康产业资本研究中心

 VIR-2218 

2017年10月，领先的RNAi疗法公司Alnylam与专注开发严重感染性疾病药物的Vir Biotechnology签订独家许可协议，授权后者临床开发和商业化HBV项目VIR-2218(ALN-HBV02)。该药通过皮下注射给药，是首个采用Alnylam公司的ESC+(增强稳定化学+)技术创制的GalNAc共轭siRNA药物。在VIR-2218的双链RNA结构中，正链上连接的GalNAc保证肝脏靶向性，负链中的乙二醇核苷酸(GNA)修饰既可增强体内效能所需的代谢稳定性，又能减少序列匹配脱靶效应。VIR-2218靶向HBV全部转录物共有的HBx基因区域，旨在沉默全部10种基因型HBV的cccDNA和整合DNA的转录。

图表10. VIR-2218的结构和作用机制示意

来源：Vir Technology官网、中康产业资本研究中心