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骨组织不同于一般的软组织，是一种坚硬的结缔组织，由骨基质和骨细胞组成。骨基质是由有机物质和无机物质紧密结合而成，主要成分有粘多糖和一些骨胶纤维构成的骨样组织以及沉着于其中的无机盐（骨盐）。无机盐以羟基磷灰石结晶的形式存在，其中绝大部分为水合磷酸钙。 组织里存有钙盐会妨碍用常规方法制作良好切片。骨组织及钙化病灶，经过固定后，必先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。如脱钙不全，切片易撕开、碎裂并损伤切片刀刃。骨和其它一些已钙化的组织在脱水、透明等制片前必需将组织中的钙盐用脱钙剂除去，才能制成 4～5 um 厚的切片。 常用的固定剂主要有甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮等，它们具有良好的固定作用。固定不当对抗原性有很大的影响，主要表现在三个方面：一是组织过大固定时间不够，使组织中心部位的抗原溶解、弥散或丢失；二是在甲醛中固定时间过长，因醛-氨基交联而降低抗原性；三是固定液的种类、浓度和温度对一些特殊抗原有很大的破坏作用。 甲醛液（formaidehyde）：又称为福尔马林（formail），对大多数抗原保存较好，是免 疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩小。最常用的固定液，能满足常规 HE 及免疫组化、PCR 等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是，中性甲醛是以 pH 7.2-7.4 的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的 4％甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间固定时间24h以内为宜，不要超过一个月。 同时，脱钙也是决定骨骼、牙齿、病理性钙化或骨化组织切片质量、染色效果的重要技术关键之一。简单、便捷、快速、有效的骨组织脱钙方法，有利于保持骨组织结构和组织中的抗原物质，对于临床正确诊断具有重要的意义。 目前，常见的脱钙剂主要有单纯酸类、混合酸类、螯合剂等。 单纯酸类脱钙剂： 主要有甲酸、硝酸、盐酸等，尤其是甲酸和硝酸应用较多。 硝酸水溶液 配方：硝酸（用0.1％尿素稳定）5-10ml，蒸馏水加至100ml。 此液用作常规脱钙剂，作用迅速，对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好，能适用多种染色技术，但每日需要更换新鲜溶液，最好早晚各一次，一般1-3天完成。横切人肋骨（5mm）在12－24小时内脱钙。 混合酸类脱钙剂： 是指两种酸类脱钙剂一起使用，或在单纯酸内加入另一种脱钙剂或少量的其他试剂所配制的脱钙液，这类脱钙液的特点是脱钙完全、快速，防止纤维组织过度膨胀，减少组织破坏对染色的影响，通过加入不同的化学成分可以弥补单纯酸类脱钙剂的不足。 1、甲酸－福尔马林液 配方：甲酸5－25ml，福尔马林5ml，蒸馏水加至100ml。 5%的甲酸是一种良好的常规脱钙剂，速度适当，组织损害小。当甲酸成分增至25%则增快脱钙速度，加入甲醛可适当保护组织不受酸损害，但应切记，增加脱钙速度只能靠牺牲细胞微细构造来获得。根据组织的厚度和钙化程度，在5％甲酸液内2－4天可完全脱钙，横切的肋骨需36－48小时。 2、福尔马林－硝酸液（Clayden氏液） 配方：福尔马林5ml，硝酸（比重1.41）7.5－15ml，蒸馏水加至100ml。 此处方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸软作用，这即具有脱钙作用，又具有固定作用，硝酸脱钙迅速，组织不膨胀，掌握好脱钙时间可直接脱水，不影响染色效果，但最好先洗去硝酸。横切人肋骨（5mm）用含7.5％硝酸液于1－2天内脱钙。 3、盐酸－氯化钠液（Von Ebner氏液） 配方：浓盐酸15ml，氯化钠7.5ml，蒸馏水加至100ml。 盐酸脱钙易使组织收缩，作用速度较快，用氯化钠作为溶剂则效果良好，牙齿脱钙时盐酸可增至10－20%。脱钙时，每日应加盐酸（0.5%）直至完成脱钙，横切的人肋骨（5毫米厚度）于36-72小时内脱钙。 EDTA： 是一种比较温和的脱钙剂，对组织的渗透性差作用慢。溶液的优选pH为中性至微酸性，适用于将进行酶测试、FISH和免疫组化。为了提高EDTA的脱钙速度，骨组织取材尽量薄小，可采用微波辅助。用微波炉辅助脱钙可以大大缩短脱钙时间，只要设置好脱钙程序、严格控制好温度和脱钙时间，一般不会对组织造成影响。 总的来说，各种脱钙液的配方都围绕着脱钙速度和消除对组织的不良影响而设计。
脱钙步骤简要概述如下：
取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片； 固定：再以10%福尔马林固定2天； 将组织置于脱钙剂中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止； 流水冲洗24小时（除酸）； 进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。
脱钙过程最重要的方面是确定脱钙终点。未能完全脱钙导致切片不良，以及HE过度嗜碱性染色。未能及时停止脱钙过程将导致嗜碱性粒细胞减少和曙红染色增加，缺乏核染色。下图可比较两个图像中脱钙骨组织的染色差异。 鉴定脱钙是否彻底，确定脱钙「终点」的三种方法： 最常用、最简单的方法是针刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力时，说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙。靠组织的柔软性测验脱钙作用靠不住，而且这种插入一根针以察觉钙沉淀的方法会造成组织损伤。 用X射线检查：看组织内是否仍有钙质。 用化学实验检查：取5ml脱钙液用2M的NaOH（氢氧化钠）调整至中性，再加5％草酸钠或草酸铵1ml，液体混浊表示有钙质。迟至5分钟仍不混浊表示脱钙液中不含有钙质。组织中仍有钙质时，一定量的钙离子会溶于脱钙液中，游离的钙会干扰脱钙作用的完成。显然，应在每次试验时完全更换，在试验中必须经过2－3小时间隔让钙溶解。
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