【原】PROTAC之后，分子胶降解剂能否迎来突破？

医药魔方 2020-11-05

展开全文

许多疾病都是由特定的致病蛋白积累引起，因此大多数药物通常采用了“锁钥”设计理念，通过直接结合在目标蛋白的结合口袋内以阻断其活性。然而，又存在很多蛋白，使用这种常规的设计方法无法达到靶向作用，我们称为“不可成药”靶点，但随着PROTAC技术的兴起，特别是近期临床结果的公布，让我们看到了靶向这些“不可成药靶点”的希望。不过，PROTAC靶向的多是胞内蛋白，对于大多数胞外蛋白又显得那么力不从心。

其实，细胞体内有着多种蛋白降解途径，泛素-蛋白酶体只是其中一种，此外还存在能够降解胞外蛋白的自噬、溶酶体降解等。近期，来自麻省理工学院、哈佛大学等机构的科学家们在Nature[1]上发表一种新的分子胶降解剂CR8，通过剖析CR8的作用机理细节，研究人员向我们展示了如何构建更多这些独特的化合物以作为多种疾病的潜在治疗方法。

CR8最初的设计是抑制在细胞生长中起重要作用的，被称为细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的化合物。研究人员使用他们的生物信息学方法发现，CR8的细胞杀伤活性与E3泛素连接酶复合物DDB1的水平相关。首先，为了鉴定通过E3泛素连接酶介导蛋白质降解的小分子，研究人员将经过578种癌细胞系测试过的4 518种临床和临床前药物的药物敏感性数据与499种E3连接酶的各自mRNA水平相关联，采用CRISPR介导的E3连接酶成分失活来验证连接酶表达与药物毒性之间的相关性。在定量的蛋白质（超过8 000种）中，细胞周期蛋白K是唯一在添加CR8后始终显示丰度降低的蛋白质，CR8不会改变细胞周期蛋白K mRNA的水平，并且CR8诱导的细胞周期蛋白K降解可以通过抑制E1泛素激活酶（使用MLN7243），抑制cullin腺苷化（MLN4924）和蛋白酶体（MG132）的抑制作用（图d）来挽救。这些表明，CR8通过含有DDB1的cullin-RING泛素的活性触发细胞周期蛋白K的快速蛋白酶体降解（图e）。

体外泛素化试验证实，仅CUL4A-RBX1-DDB1连接酶核心足以驱动细胞周期蛋白K的强大泛素化。在没有药物的条件下，体外仍可检测到CDK12-cyclinK与DDB1之间的弱相互作用，但CR8增强了复合物的形成。相互作用的定量显示，CR8在100-500 nM的范围内刺激CDK12-cyclin K和DDB1之间的结合，表明CR8参与的CDK12-cyclinK通过DDB1被募集到CUL4-RBX1-DDB1连接酶核心，并且CR8充分拉紧了复合物，以驱动CR8诱导的cyclin K降解。

其他团队曾研究了一种结构类似于CR8的药物，发现它不会导致细胞周期蛋白K降解。两种化合物之间唯一的结构差异是突出的吡啶基化学部分。研究小组得出结论，该部分足以使CR8像分子胶降解剂一样发挥作用。该发现表明，抑制剂向外部分的化学修饰可将其转变为针对特定蛋白质靶点的分子胶降解剂。

最后，为了检查与非降解CDK抑制相比，CUL4介导的细胞周期蛋白K降解如何增益CR8细胞毒性，研究人员分析了野生型HEK293T-Cas9细胞，以及经预处理的可能会导致DCAF过度表达或DDB1基因缺失细胞中的CR8毒性。结果显示，MLN4924全面抑制cullin-RING连接酶的活性仅对细胞活力产生较小的影响，但导致对CR8的敏感性降低，表明cullin-RING的酰化作用连接酶实质上有助于CR8毒性。底物受体CRBN的过表达也影响了细胞对CR8的敏感性，并降低了细胞周期蛋白K的降解。正如预期的那样，CR8诱导的细胞周期蛋白K降解取决于DDB1，并且一致地，在缺乏DDB1的细胞中，CR8（而非其他CDK抑制剂）的细胞毒性要低十倍。

“我们已经表明，可以采用常规的激酶抑制剂，并通过连接特定的化学基团，将其转化为分子胶降解剂，”该研究的共同作者、Dana-Farber癌症研究所医学肿瘤学系主任Benjamin Ebert说，“这提供了创造分子胶降解剂的潜力，可用于比我们最初预期的更广泛的治疗目标。”

这些发现表明，利用蛋白质-蛋白质界面的小分子诱导的激酶失活，为改善药物选择性提供了一条途径，证明修饰结合靶标小分子的表面暴露区域是一种合理的策略，可用于开发给定蛋白质靶标的分子胶降解剂。

看到这里，不禁令人想到不久前发表在JMC[2]的一篇文章，当时的研究人员在研究Bcl6抑制剂，却发现了可将Bcl6降解的化合物。

研究人员使用荧光偏振（FP）分析，采用高通量筛选中HIT化合物2和3（表1），这些化合物的效价较弱（IC50〜100μM）。由于较差的溶解性阻碍了获得配体结合的X射线结构，为了解决这个问题，进一步制备了具有亲脂性降低的含较少芳香环类似物。化合物4和5表现出与先前得到的化合物相当的活性，并提高了溶解度（表1），从而能够确定X射线结构。

通过对蛋白晶体的分析，发现化合物在BCL6的BTB域的二聚体界面处结合（图A和图B）。4和5共有两个相互作用特征：从NH到Met51的骨架羰基的氢键以及它们的氰基吡啶部分插入蛋白质表面上Tyr58和Asn21之间的缝隙中，从而在氰基吡啶和Tyr58的侧链之间产生关键的疏水相互作用。化合物4通过其苯并咪唑酮核的氧原子与Glu115的主链NH和经水分子介导与His116的主链NH形成另外的相互作用。5的环丙基基团仅与残基53-55的骨架形成弱疏水相互作用，这表明5的氯氰基吡啶提供了该化合物的大部分结合亲和力。

因此，研究人员假设将苯并咪唑酮核心与5的氯氰基吡啶结合使用会导致效力增加。令人欣慰的是，所得化合物6（CCT365386）的结合亲和力确实得到改善，提高到10μM。此后，研究人员继续针对提高化合物的效力和溶解性进行研究，然而，在研究中却发现，化合物24b处理的SU-DHL4和OCI-Ly1细胞，与化合物介导的BCL6降解一致，蛋白质裂解物的Western分析表明BCL6蛋白水平呈浓度依赖性降低。

鉴于上述图中R3位置不同的取代基表现的Bcl6降解能力，同时考虑到小分子降解物的催化作用，无需对BCL6完全连续占据的需要，可能在较低浓度的化合物中便具有活性，因此研究人员开始决定专注于这种新型BCL6降解物的优化，旨在鉴定具有合适理化和药代动力学特性的化合物，最终发现了CCT369260。

通过对造成具有化合物降解作用的哌啶基的蛋白结合位置分析，他们发现该基团同样处于二聚体界面的表面暴露区域。

研究人员对这类分子促进蛋白降解的一种相关潜在机制进行了推测，一种可能是通过“疏水标记”，降解剂结合目标蛋白，并在表面上以“疏水性斑点”形式出现，模仿部分未折叠的蛋白状态，然后将其进行靶向降解。另外一种假设是蛋白质表面和降解剂的结合形成了可以被E3泛素连接酶或其他蛋白酶体降解的效应子识别的“新底物(neo-substrate)”或“新降解子(neo-Degron)”。

这两篇文献提示我们，对分子在蛋白质-蛋白质界面或靶标结合口袋表面暴露区域的结构进行修饰有望发现新的分子胶蛋白降解剂，但对于如何进行合理设计、选取那些片段能够使小分子抑制剂转变为降解剂仍然是有待解决的问题。

新靶点、新疗法、新技术

欢迎进群交流学习

相关论文：

[1] Mikołaj Słabicki et al. The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K, Nature (2020). DOI:10.1038/s41586-020-2374-x

[2] Benjamin R.Bellenie, et al,. Achieving In Vivo Target Depletion through the Discovery and Optimization of Benzimidazolone BCL6 Degraders, DOI:10.1021/acs.jmedchem.9b02076

新靶点

NKG2A | GARP | CD22 | LIF | CDK2 | WWP1 | VCAM1 | Flower | CD24 | Gingipains | DES1 | GPR139 | DHX37 | CXCL10-CXCR3轴 | 628个靶点 | CA19-9 | PTPN2