肿瘤研究|从组织处理、培养到鉴定分析

ypgao 2020-11-25

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那么在对肿瘤细胞的研究中，我们最常遇到的难题包括哪些呢？首先从肿瘤组织中获得细胞的第一步就是制备单细胞悬液，目前一般使用消化酶来消化肿瘤组织。其中包括消化酶的选择、消化的时间、是否需要去除红细胞等都是在实验操作中值得我们注意的地方。其次，在进行细胞系培养的过程中，如何培养出更具有生理相关性的肿瘤细胞才能更好地达到我们的研究目的？除此之外，怎样鉴定我们得到的细胞是目的肿瘤细胞呢？针对这些问题，今天这一期推文我们来具体聊一聊。

从肿瘤组织制备单细胞悬液

下述操作步骤适用于乳腺癌（4T1）、黑色素瘤（B16-F10）和结肠癌（CT26.WT）的小鼠模型的实体瘤或人乳腺癌和卵巢癌组织。若您使用的是其它肿瘤组织，消化步骤需进一步优化，详情请咨询我们的技术支持。

实验步骤

该步骤中所用的试剂体积适用于处理少于1.0g的肿瘤组织。若您需要处理大于1.0g的肿瘤组织，请适当调整体积。

1. 混合以下试剂，以制备5 mL的肿瘤组织消化液：

- 500 μL胶原酶/透明质酸酶溶液（产品号 #07912）

- 750 μL DNase I溶液（1 mg/mL；产品号 #07900）

- 3.75 mL RPMI 1640培养基（产品号 #36750）

充分混匀并预热至室温（15 - 25°C）；

2. 将肿瘤组织收集到35 mm培养皿（产品号 #27100）中，用剪刀或手术刀将肿瘤组织切碎成小块（≤ 2 mm）；

3. 将剪碎的肿瘤组织转移至14 mL圆底管（产品号 #38008），并加入步骤1中混匀的消化液；

4. 在37°C摇床，90 rpm，孵育25分钟；

5. 将70 μm细胞过滤器（产品号 #27260）置于50 mL无菌锥形管（产品号 #38010）上，并使用推荐溶液（EasySep?缓冲液，产品号 #20144，或含2%FBS和1 mM EDTA的PBS。注意溶液不含Ca 和Mg ）润洗滤网；

6. 将4中充分孵育的肿瘤组织混合液从培养皿转移至润洗过的70 μm细胞过滤器，使用无菌注射器的活塞/柱塞，以温和画圆的方式使细胞和组织通过滤网。接着使用推荐溶液冲洗滤网并将其收集至同一锥形管中，最后使用推荐溶液将锥形管中溶液体积补充至50 mL；

7. 室温下300 x g，离心10分钟，小心去除上清液；

注意：离心过程中将离心机设置为缓慢加速和减速。

8. 在收集的细胞中加入10 mL氯化铵溶液（产品号 #07800），室温下孵育5分钟；

注意：此步骤是为了去除红细胞。对于一些无需去除红细胞的肿瘤组织，可忽略8、9步骤。

9. 加入推荐溶液至50 mL，室温下300 x g，离心10分钟，小心去除上清液；

注意：离心过程中将离心机设置为缓慢加速和减速。

10. 对于人的肿瘤组织，将细胞按1 x 10^8 cells/mL的浓度重悬于推荐溶液中；对于小鼠的肿瘤组织，将细胞按5 x 10^7 cells/mL的浓度重悬于推荐溶液中。

注意：若需要从小鼠肿瘤中获得更高纯度的TIL，可将细胞按5-10 x 10^7 cells/mL浓度重悬；若需要获得更多的TIL，即回收率更高，可按1-2.5 x 10^7 cells/mL浓度进行重悬。

肿瘤细胞的培养

传统的2D贴壁细胞培养模型由于缺乏体内组织微环境导致细胞结构与体内存在显著差异，从而导致药物响应模式及信号分子通路的表达与生物体内显著不同。而3D细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，更贴近肿瘤组织相应的病理生理特征。目前3D肿瘤球培养模型已经逐渐应用于肿瘤细胞的培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选等特定应用中。

STEMCELL的AggreWell?培养板（产品号 #34460）即可进行细胞的3D培养，通过它可轻松生成大小均一的3D肿瘤球（图1），并且适用于多种肿瘤细胞类型，包括乳腺癌[1]，前列腺癌[2]，结肠癌[2]，肝癌[3,4]，小胶质细胞瘤细胞系[5]等。

图1. 使用AggreWell?生成的肿瘤球大小、形态均一

（A）结肠癌细胞系HT29（B）前列腺癌细胞系LNCap（C）食管癌细胞系TE6。所有细胞球都按每微孔100个细胞的密度铺板。放大倍数为10X。图片由卡尔加里大学的Golsa Razian和Mark Ungrin友情提供。

肿瘤干细胞的鉴定

肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell, CSC）是一种独特的肿瘤细胞亚群，具有类似干细胞的自我更新、多能分化和无限增殖的能力。CSCs已被广泛认为是癌症进展、复发、治疗耐药以及转移的原因。不同肿瘤的CSC具有不同的表面标志物，比如CD133 、CD44 CD24-等[6]。此外，还可以用检测细胞内乙醛脱氢酶（ALDH）活性的方法来检测肿瘤干细胞。

ALDH的活性已经被证实在多种组织中可以作为具有干细胞特性的恶性细胞的有用标志物。在多发性骨髓瘤和急性髓细胞白血病（AML）[7-9]、前列腺癌[10]、结肠癌[11,12]、头颈癌[13,14]、甲状腺癌[15]、乳腺癌[16-18]、肝癌[19]、卵巢癌[20]、宫颈癌[21]、膀胱癌[22]、脑癌[23]和肺癌[24]中，都发现了ALDH的表达增加。也有研究显示，ALDH表型与多种癌症的不良预后结果有关[18,25,26]。ALDH的活性是通过ALDEFLUOR?（产品号 #01700），一种非免疫的荧光试剂来检测的，已被超过1000篇文献所引用。查看以下视频，了解ALDEFLUOR?检测肿瘤干细胞的技术原理。