本人主要是做植物的,所以本次的实例也只是植物方面的 1.WGCNA应用场景
2.WGCNA实验设计
3.单个材料案例《Floral Transcriptomes in Woodland Strawberry Uncover Developing Receptacle and Anther Gene Networks》 野草莓花器官转录组解析花发育中花托和花药的基因调控网络 3.1方案设计
3.2 转录组数据整体分析3.2 鉴定配子体孢子体相关基因在不同发育时期花药中共同表达的基因鉴定为雄性孢子体特异性基因 GO富集显示,雄性孢子基因集主要为代谢生物学过程,如小分子、有机酸、细胞内酮代谢等等 在花粉和小孢子特异表达的基因中共同表达的基因鉴定为配子体特异基因 3.3花发育过程转录组的时空表达模式分析对所有差异表达的基因进行K-means聚类分析鉴定19个cluster,呈现出发育时期和组织特异性表达模式,如C1 C22为心皮特异性 进一步将19个cluster合并为10个supercluster,并进行功能富集分析,如心皮特异性的supercluster,并进行功能富集分析。如心皮特异性的supercluster1富集的功能为DNA合成。 对cluster中的161个转录因子进行表达量聚类分析,也呈现发育时期和组织特异性的表达模式。 3.4 WGCNA构建共表达网络用差异表达基因进行WGCNA分析,鉴定了23个基因模块。 用每个模块的epigengene值与不同组织样品进行关联分析,鉴定组织紧密关联的基因模块。 12个模块与单一的组织样品特异性高度相关,如blue模块与花粉(pollen)特异性相关。 WGCNA鉴定的组织特异性基因集合与K-means的结果相符合 WGCNA鉴定的花托特异性模块(light yellow)和幼嫩花(stage1-4)特异性模块(dark red),在K-means的cluster中并没有 3.5 组织特异性表达模块WGCNA鉴定的花托特异性模块(light yellow)和幼嫩花(stage1-4)特异性模块,在K-means的cluster中并没有。 分析了Dark red模块和Light yellow模块epigengene在各样品中的表达模式 热图呈现了Dark red模块和Light yellow模块中每个基因在各个样品中的表达模式 3.6 花托特异性模块内部分析关键基因(hub gene):模块内网络中连接度较多的基因。 关注模块中的转录因子:花托特异性模块111个基因中有27个转录因子,重点分析这些转录因子。 大部分hub gene为参与调控分生组织的转录因子,如WOX、GRS、NAC等。 hub gene中连接度最高的为GRS转录因子家族的FveLOM3。拟南芥中三突变体lom1 lom2 lom3表现出分生组织异常的表型。因此FveLOM3可能是花托发育的关键调控因子。 此外,高连接度的hub gene还包括一个B3 domain转录因子、一个Myb转录因子和WUS同源基因 3.7 花药发育差异基因分析stage9花药中上调表达的1453个基因中,211个编码FBX domain蛋白。在野草莓基因组中包含820个FBX基因。大比例FBX上调表达说明在花药减数分裂这个时期发生了大量的蛋白降解。 K-means的cluster富集分析中花药-9的cluster富集的为蛋白降解。 FBX基因表达聚类热图分析显示,大部分FBX只在stage9时期暂时高表达,随后的stage10和11下调表达。 在花药发育过程中,共296个FBX基因差异表达,其中6个亚家族占的比例较大,包括FBD、LRR、DUF295 3.8花药特异性模块分析花药stage9特异性基因模块为pink,其中包含了37个FBX基因。 通过筛选连接度较高的基因来鉴定hub gene。5个基因的度数目高于200。 其中4个基因参与蛋白降解,F-box、WD-repeat ![]() 3.8 小结:WGCNA分析思路实验方案:单个材料,不同组织样品,所有差异表达基因进行WGCNA分析 通过模块Epigengene值与不同组织样本进行关联分析,鉴定组织特异性模块 hub基因筛选 连接度较高的基因 重点关注转录因子(花托特异性模块) 前期结果中的目标基因(话要特异性模块中的FBX) 4.两个材料《Global transcriptome and coexpression network analyses reveal cultivara specific molecular signatures associated with seed development and seed size/weight determination in chickpea》 4.1方案设计![]() 4.2 两个鹰嘴豆栽培种的种子发育表性分析两个鹰嘴豆栽培种Himchana1(小种子,平均100粒种子重量为13.1g)和JGK3(大 种子的不同发育阶段S1-S7依据授粉天数(Day after Pollination,DAP)划分,5、9.12,19,25、30和40 DAP分别为S1、S2、S3.S4、S5、S6和S7. 表型分析:种子发育不同时间点的种子重量和大小的统计数据比较。 ![]() 4.3 两个材料种子发育过程转录组的整体解析为了分析两个材料种子发育过程转录组动态变化的差异,基于16个组织样品所有表达基因的表达量的斯皮尔曼相关系数(SCC)进行层次聚类和主成分分析(PCA)。 两个材料中相同发育时期组织样品表现出很高的相关性。 ![]() 4.4 种子发育过程中差异基因表达分析鉴定种子发育过程中每个时期特异表达的基因 各个时期特异表达的基因数目差异很大,S2最少,S5最多。 ![]() 4.5两个材料差异表达基因分析定两个材料在种子发育每个时期的显著差异表达基因集。 ![]() 4.6 WGCNA鉴定共表达基因模块WGCNA分别鉴定了HC1的27个基因模块和JGK3的21个基因模块。 ![]() 4.7 两个材料的基因模块保守性分析鉴定两个材料共表达基因模块的保守性。 ![]() 4.8 种子发育和种子大小、重量相关转录调控模块分析目的:鉴定JGK3发育S3和S5的转录调控网络。主要为TFs及其共表达的靶基因(包含TFs结合位点,motif显著富集分析) 候选模块:HC1和JGK3中与S3、S5时期相关的共表达基因模块 JGK3的S3时期相关模块brown转录调控网络:显著富集的DNA motifs有ATHB1、JASE1等,相关的TFs有woX9、PDF2、RLT2等,以及靶基因相关的GO term,基因表达调控、细胞壁组装、表达大小调控等。 比较JS3和HS3模块转录调控网络,大部分组分是相同的,但是也有一些材料特异性的组分。 同样也分析了JS5和HS5相关模块转录调控网络组分,包括DNA motifs、TFs,以及GO term。 JS5和HS5的调控网络大部分组分是相同的,但是也有一些材料特异性的组分。 该分析鉴定了种子发育中的关键调控因子,两个材料的调控相似但不完全一样。 ![]() 4.9 种子发育和种子大小、重量相关转录调控模块分析一些基因模块在两个材料的S3和S5时期表现出相反表达模式。 主要有3类:HS3下调JS3上调,HS3上调JS3下调,HS5下调JS5上调。 这些模块可能与两个材料种子发育不同相关,进行转录调控网络分析。 HJ3上调JS3下调转录调控网络鉴定:motifs、TF、GOterms。 S3时期的top hub基因表达模式反应了这不同模块中所有基因的表达模式。 这些网络中的许多motifs、TFs都是已知参与调控种子大小、重量的重要调控因子。 ![]() 4.10 小结实验方案:两个材料,不同发育时期样品,所有差异表达基因进行WGCNA分析。 5. 表型数据《Root Cell-Specific Regulators of Phosphate-Dependent Growth》 5.1 PRCE在根部的细胞特异性表达验证和T-DNA插入突变体筛选构建了12个PRCE基因的启动子-GFP转基因line,验证它们是否呈现细胞特异性表达模式。 ![]() 5.2 突变体表型分析prce突变体在磷足够和缺乏条件下,植物根和芽中磷的浓度变化。 ![]() ![]() 5.3 prce突变体根中相应基因的转录水平变化选取以前发表文献中的缺磷的两个转录组数据集,包含不同的基因型材料,其中Col-0和phr1-1为对照材料。 在两个数据集中,Col-0的63%和6%的PSR基因在phr1-1中没有变化;许多野生型PSR基因在prce突变体中呈现出不同的表达。 在两个数据集中筛选了Col-0中差异表达2倍以上的831个磷响应核心基因,进步通过层次聚类分析其在不同基因型材料中的表达模式。并依据基因表达模式分析不同基因型样品之间的关系。 S6k2突变体表现出与phr1-1类似的缺磷反应,而wdd1突变体表现出类似Col-0的缺磷反应。 ![]() 5.4 鉴定prce突变体相关共表达网络对32个RNA-seq数据集(磷足够和磷缺乏)的所有表达转录本分别进行WGCNA分析,都鉴定了18个共表达基因模块。 ![]() 5.5 重点模块和模块内hub基因分析缺磷的yellow模块,包含684个基因,与生物量、磷含量、根芽比例都显著相关。其中24%基因与之前转录组鉴定的PSI基因相一致。 模块基因,相对野生型,在phr1-1中下调表达,在prce突变体(cb/1、prce2等)上调表达。 筛选与该模块的ME(kME)排在前300的基因进行富集分析,显著富集的GO term有缺磷相关、磷脂和半乳糖脂代谢等。 模块hub gene筛选:kME大于0.9。主要为脂代谢、感知磷、磷信号导、磷运输等相关基因。 Yellow模块在cb/1中表现较高的ME值,说明钙信号通过CBL1影响磷转运。进一步筛选该模块中钙信号相关基因,重点关注,作为hub gene候选。 ![]() ![]() 5.6 小结实验方案:两种处理,不同基因型样品,所有表达基因进行WGCNA分析。 |
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