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按：博士后研究行将结束，我想应该很少有人能像我一样幸运，从研究生入学开始接触一个课题，将近十年，从对课题一无所知，懵懵懂懂到现在开始有点自己的想法。期间的辛酸甘甜，只有经历过的人才懂得。 缘起： 一切还要从40多年前的一株油菜雄性不育株的发现说起，彼时上海市农科院李树林先生在四川省宜宾地区发现了一株油菜不育系并命名为宜3A。经过系统的遗传分析，他们发现在油菜里既可以找到该不育系的恢复系，又能找到其保持系，于是李树林先生提出了宜3A油菜显性细胞核雄性不育性是由两对显性基因Ms和Rf互作控制的遗传理论。这样，育种家不仅可以像小麦的太谷核不育基因（Ms2）一样，用这个显性核不育材料进行轮回选择育种，还可以在生产上进行三系制种。之后国内研究机构育种大协作，使得各个油菜单位都拿到了这一不育系。 进入21世纪后，基因定位开始兴起，大家在进行Ms和Rf的遗传定位时发现，这两个基因位于同一个地方，于是华中农业大学陆光远、宋来强和洪登峰等根据新的遗传分析和标记定位结果，对遗传模式进行了修正。修正后的遗传模式如下图所示：油菜育性受到同一基因位点的三个复等位基因控制，分别为MS5a（恢复基因），MS5b（不育基因）和MS5c（正常可育或临保系基因），且三者之间的显隐性关系为MS5a > MS5b > MS5c（图1A）。因此，在MS5b处于纯合状态或者基因型为MS5bMS5c的杂合状态时，单株表现为雄性不育；而MS5a基因型存在时，或者MS5c处于纯合时，单株则表现为可育。根据这一遗传关系，也可以指导三系制种。在三系制种过程中，不育系的保存和扩繁需要遗传背景相同的ABC三个系，它们分别为同源两型系AB，其中不育株A基因型为MS5bMS5b，可育株B基因型为MS5aMS5b；临保系C基因型为MS5cMS5c。在制种过程中，首先通过AB系杂交后可以获得不育和可育1:1分离的群体，拔除50%的可育株即可得到纯合不育株群体。剩余的纯合不育株与临保系C在隔离条件下自由授粉杂交，即可大量繁殖用于制种的100%不育系，基因型为MS5bMS5c。最后，这些全不育系通过与恢复系（MS5aMS5a）杂交，即可获得F1杂交种（图1B）。 图1 MS5遗传模式及三系制种示意图 说句实在话，油菜里现在在用的两套细胞核雄性不育系统遗传（MS5调控显性细胞核雄性不育系统和MS3，Rf（MS4）调控的隐性细胞核雄性不育系统）和命名都特别复杂，搞得很多育种学的老师云里雾里，这更多地要归咎于历史原因，前期大家对遗传和基因调控认识不清楚，但命名已经完成，现在搞清楚了，又不能随便更改以前的命名，甚是麻烦。说回正题，我研究生开始阶段主要是跟随实验室卢卫师兄（现在在中南民大当老师）进行MS5基因的精细定位和转基因验证工作。当时通过定位将候选区段缩小到21Kb的两个基因上，通过将恢复基因转到不育系中验证得到了我们想要的恢复基因MS5a。但是，这期间遇到一个麻烦事，不育基因通过PCR扩增死活拿不到！这时师兄已到毕业年限，遗憾发表了一篇精细定位的文章，工作去了。留下还是小白的我独自风中凌乱！ 接班： 课题交到手上，那就只能硬着头皮上了，理论上等位基因变异应该很小，MS5a和MS5c都能通过PCR扩增直接拿到，不育基因扩增不出来说明这个地方发生了很大的变异。没办法，我们下血本，花大价钱用不育系做了一个BAC文库，通过标记筛文库，筛到克隆后测BAC，终于搞定了MS5b。三个等位基因终于凑齐，来看看它们的庐山真面目：MS5编码一个功能未知的十字花科芸薹属特异蛋白，其N端有一个预测的coiled coil结构域，C端为一个功能未知的DUF626结构域（图2）。序列比对分析显示，在芸薹属物种之外没有找到MS5基因的直系同源基因。三个复等位基因的序列比对分析显示，MS5a和MS5c在编码区序列差异较小，仅有18个氨基酸的差异，但启动子区序列一致性仅为56.1%，差异较大。MS5b则为MS5a在第二个内含子区内插入了一个8Kb多的MULE类转座子。怪不得之前一直扩增不出来，看到这个转座子后，我们就想当然的认为，转座子插入后造成了MS5的功能缺失，进而引起了不育。这一想当然让我们后续复等位遗传机理的探明耽搁了好几年，切忌你以为你以为的就是你以为的。 图2 MS5基因结构和进化分析 突破： 之后就是基因功能研究的常规操作了，跟师妹李玺（现在在中国林科院工作）合作我们做了基因的表达分析，观察不育造成的原因。发现是因为减数分裂异常造成的雄性不育后，我们又跟中科院遗传发育所程祝宽老师合作，对我们材料的减数分裂进行了详细的研究。细胞学观察发现，在不育系中，小孢子母细胞减数分裂异常，与育性正常材料相比，不育系小孢子母细胞在偶线期染色体形态开始异常，之后减数分裂过程停滞，染色体浓缩为一团，最后染色体完全降解。进一步分析减数分裂进程发现，不育系中减数分裂前期虽然DNA双链断裂（DSB）可以正常完成，但端粒花束状结构没有正常形成，同源染色体常配对出现异常，联会复合体没能正常组装，也没有看到DSB的同源重组修复。这一部分内容我们与合作者一起发表在了the Plant Cell上，算是有了一个小小的突破。（MS5 Mediates Early Meiotic Progression and Its Natural Variants May HaveApplications for Hybrid Production in Brassica napus, 2016） 图3 MS5在减数分裂中的功能 困惑： 文章发表后，我也该博士毕业了，啦啦啦！。当时跟导师商量，想留下来做分子育种，立志把现在克隆的基因在农业生产上给用起来，现在想想还有点热血沸腾呢 虽然我们克隆了MS5基因，但是还有两个问题始终萦绕在我的脑海：1，MS5作为一个芸薹属特异的孤儿基因，到底是怎么调控减数分裂的呢？2，MS5位点复等位遗传背后的分子机理？针对这两个问题，我们兵分两路，一方面解析MS5蛋白结构，筛选互作蛋白，从生化和调控网络入手解析其调控减数分裂的机理；另一方面，通过基因敲除，启动子互换等手段，解析复等位遗传的分子机理。 探索： 博后阶段一部分精力放到分子育种上，好在有师弟王祥（现在在瑞士苏黎世大学做博后），一直跟殷平老师合作进行结构生物学研究，已经积累了很好的基础。他摸索了很多条件后顺利把MS5结晶并解析了结构，根据结构初步知道了其核心结构域的生化功能。互作蛋白筛选的工作也进行的比较顺利，通过筛酵母文库，IP-MS等方法，筛选出一系列的互作蛋白。可惜的是，我们并没找到一个很好的切入点，将生化功能与筛选到的互作蛋白联系起来。只能遗憾的将结构部分的内容先发表出去，占个先机。 复等位遗传机理研究着实费了一些脑细胞，因为MS5a和MS5c纯合时都是正常的，那MS5b为什么与MS5c杂合时会是不育的呢？我们考虑过很多假设，单倍剂量不足，MS5b区段有小RNA产生等等，找很多人讨论，但思来想去都找不到依据，之前想当然认为MS5b是功能缺失基因，现在无路可走了，就又想起要不把MS5b转到保持系里看一下，是不是这地方真的有什么东西。费劲巴拉地把12Kb连到了互补载体上，转化后发现竟然真的可以导致临保系产生不育表型，此时启动子互换的转基因结果也看到了表型，两者一结合，我们确认了MS5b不是我们之前认为的null mutant，而是有功能的，会对MS5c产生显性负效应。这时突然想起很久以前我们好像测过不育系的转录组，拿过来往MS5b区段一map，不得了了，竟然有两个可能的转录本，其中一个就包含我们MS5前半部分，里面有一个介导互作的coiled coil结构域（图4）。 图4 MS5b区段转录本 到这里突然有点要豁然开朗的意思了
图5 MS5复等位遗产机理 没有完结： 围绕着MS5折腾近十年，虽有不舍也难续情缘了。脑海中的两个疑问也仅解决了一个半，本想当个终结者谁曾想成了奠基人。回想整个研究过程中最难熬的就是那些没有方向的日子，套路都走完了接下来该往哪里走呢？其实，事后想想也没有那么难，走得难走得慢的原因是因为自己想偷懒，比如MS5b之所以那么晚才发现它的显性负效应，就是因为当初偷懒想当然的下了结论。至于MS5如何参与调控减数分裂的，现在也有了大致方向，后浪们加油，我就躺在沙滩上了！ 总结一下经验教训，拿小本本记一下 1 作物的遗传学实验一定想清楚，想仔细，想全面后再开始做，时间不等人，落了哪个就又要等一年半载了。 2 排除一种可能性一定要有充足的证据。 3 多交流，多合作，多谦虚地请教，多不要脸地纠缠，你的面子一文不值。 4 跟比你强的人合作，讨论。 5 利用好的平台比自己努力要重要，中科院程祝宽老师的细胞学平台，华中农大殷平老师团队的蛋白平台，真棒 5 合理利用时间，别把战线拉太长，像我这样一个课题做十年不可取。 后记：十年饮冰，难凉热血。人生前三十年算是画上了一个句点，虽然现在还没有什么成就，未来的科研也要从头再来。但感谢这十年，让我知道什么是做研究，什么是搞育种。好在道路已渐清晰，他日再见！ 看我写的这么情真意切，转发，关注一下子呗！看都看完了，点个 在看 再走啊 |
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。业余可以再做做
，之前王祥在做晶体结构时，表达了一大堆
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