【原】山中伸弥：多能干细胞临床治疗的机遇和挑战

来源：京都大学iPS細胞研究所

在最艰苦的岁月里，怀抱希望，相信总有一天，你会笑着跟人诉说你身上的每一道伤痕。

撰文：社长

来源：细胞学社

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干细胞疗法是指利用干细胞或干细胞衍生的细胞，以特殊技术移植到体内，取代或修复病人受损的细胞、组织或器官。多能干细胞可在体外无限扩增，并能分化为所有三个胚层的细胞，成为细胞疗法最适合的细胞来源。多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSC），以胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）和诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）为代表。

1998年首次报道人胚胎干细胞（ESC）培养成功，2007年首次报道人诱导的多能干细胞（iPSC）获得成功。多能干细胞逐渐被探索用于各种疾病和损伤的细胞治疗，如帕金森，脊髓损伤、年龄相关黄斑变性等。关于临床应用，ESCs存在两个问题：人类胚胎使用的伦理问题和移植后的免疫排斥。于是，许多研究小组尝试将iPSCs临床应用，并且其中一些已经开展了临床试验。

图1. 使用PSC进行细胞治疗的临床试验

人们对基于多能干细胞的细胞治疗寄予无限期待，但是，临床转化仍然遇到了许多问题。目前，基于多能干细胞的细胞治疗面临三大挑战——致瘤性、免疫原性和异质性。

温故而知新，来自日本京都大学的山中伸弥教授在Cell Stem Cell 上回顾了二十年来针对这三个问题的研究，并讨论提供潜在的解决方案，以期加速基于多能干细胞的细胞疗法的发展。 

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挑战之一：致瘤性

多能干细胞的体外无限增殖潜能，可喜易可悲，这无疑是一把双刃剑。虽然可以提供大量各种类型的细胞来源，可以量产，但是如果细胞移植后在体内扩增可能导致肿瘤。其致瘤原因分析大致如下：

1.未分化和/未成熟细胞引起的致瘤性

多能干细胞治疗中最严重的问题无疑是畸胎瘤的形成。多能干细胞产品在体内可能形成肿瘤或异位组织，特别是当移植到患者体内的最终产品存在残留多能干细胞或高度增殖的祖细胞时，风险更甚，导致畸胎瘤或其他肿瘤。因此，研究人员必须防止畸胎瘤和其他肿瘤产生。在细胞移植治疗中，移植的细胞越少，肿瘤发生的风险就越小。

想要减少畸胎瘤发生，首先要建立有效的体外定向分化。Takahashi等在首次临床移植工作中获得了>95%的纯度，在这项工作中，将iPSC衍生的视网膜色素上皮细胞应用于年龄相关性黄斑变性患者，几乎没有剩余的细胞对未分化细胞的标记物呈阳性。所需的细胞数量相对较少，加上移植部位容易获得，因此在2014年进行了临床试验，距首次报告iPSC仅用了7年时间。

其次要纯化去除未分化的细胞。分化细胞的持续扩增也可能诱导肿瘤。严格筛选iPSC细胞系也变得十分重要。抑制细胞复制殖的关键信号通路，已被用来抑制未成熟神经祖细胞致瘤性。在受体和移植的iPSC之间故意错误HLA等位基因，这样当出现意外细胞增殖时，就可以通过停用免疫抑制剂来消除移植细胞。

2. 重编程因子引起的致瘤性

这是iPSC细胞移植所特有的风险。iPSC产生过程中的四种重要的重编程因子均与致瘤性相关，尤其是c-Myc。为了增加重编程效率的因子，如p53的显性阴性突变体等也会致瘤。因此，在iPSC用于临床细胞治疗时，要谨慎地排除这些致癌转基因的整合。

3. 基因变异引起的致瘤性

基因变异引起肿瘤的风险在多能干细胞和其他任何体外扩增培养的细胞中都会出现。一般情况下，染色体的异常（如染色体缺失、重复或重排），可以通过核型分析来检测，避免异常细胞用于细胞治疗。

如果是小范围的基因改变（如单核苷酸变异和拷贝数变异），这需要基因测序才能检测，全基因组测序可以检测到大部分变化。还以一类是是在细胞分化后发生的低，容易被忽视。

还有一个关键问题尚不清楚，iPSC重编程本身是否具有诱变性。这是个有争议的问题，尽管有研究给出了肯定的回答，但是需要被进一步探讨和解决。

另外，发生基因突变时，但不一定会增加癌症风险，从而停止多能干细胞的细胞治疗呢？

同样的突变是否会影响不同疾病的治疗，这个不清楚。目前对于癌症基因的定义，并没有统一的认识。必须承认的是，并非所有癌基因突变都是致病的。即使是健康的个体也存在着癌基因的突变，从而增加了风险分析的复杂性。

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挑战二：免疫原性

细胞治疗的另一个关键问题是免疫排斥反应。虽存争议，但临床研究表明在规避免疫应答方面，iPSC为患者自体移植提供了一个理想选择。目前，出于时间和金钱成本考虑，异体移植比自体移植方式更受青睐，尤其是一些急性疾病如心脏衰竭和脊髓受损等。

异体移植克服免疫排斥反应的传统方法是采用免疫抑制剂。在免疫赦免的组织（如中枢神经系统和眼睛），可以缩短免疫抑制剂的使用时间。但是免疫赦免可被损伤或疾病所破坏，也可能随着年龄增长而衰弱。而非免疫赦免组织的异种移植患者终身都将使用免疫抑制剂。

人类多能干细胞的HLA单倍型库

克服免疫排斥反应还有一种方法，那就是HLA单倍型匹配，这是目前广泛应用于造血干细胞移植的方法。即使用了HLA匹配，免疫抑制剂仍是需要的，不过可以减少免疫抑制的剂量和持续时间。

建立基于HLA单倍型的人类iPSC库。iPSC可以从HLA单倍型捐赠者身上获得。通过与现有的生物库（如骨髓库和脐带血库）合作，可以有效地识别HLA纯合供体。一旦获得知情同意，就可以采集血样，制备iPSC。在脐带血库，库中的冷冻血样同样可用于制备iPSC。一个国家或民族中罕见的单倍型可通过国际合作得到解决。

图2、HLA纯合供体的优势

HLA“隐身”法

随着基因编辑技术，尤其是CRISPR技术的出现，多能干细胞中的HLA基因可以被失活。一种新的减少免疫排斥的方法——HLA“隐身”出现了。

HLA单倍型匹配和HLA“隐身”各有其利弊。前者避免了脱靶效应，但是其对NK细胞攻击的敏感性可能低。目前，生产GMP级的多能干细胞生产线至少需要花费20万美元。此外，监管部门将要求对每一个细胞株进行严格的临床前数据。细胞系之间的异质性是使用多个细胞系进行细胞治疗的一个障碍。而HLA“隐身”法的最大的优势在于，利用少量的细胞系即可覆盖整个世界人群，有可能成为通用型细胞来源。既可减少细胞治疗时间和金钱成本，也可减小细胞异质性。

图3 HLA“隐身”法减少异种移植免疫原性

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挑战三：异质性

异质性在任何多能干细胞中都是存在的。在形态、生长曲线、基因表达和分化的倾向上，每个多能干细胞系都不同，这就是异质性，是其后续应用的主要障碍。不论哪种多能干细胞，遗传变异和表观遗传修饰均是其异质性的主要原因。

为了克服异质性，研究人员试图将多能干细胞的启动状态转化为初始状态。目前有多种方法被报道用来诱导多能干细胞的“初始”或基态多能性，结合使用生长因子的化学抑制剂是其中一种方法。

初始状态的多能干细胞面临着两个很重要的问题：其一在于其基因的完整性。初始状态的多能干细胞更容易出现染色体异常，需要进一步研究来解决这个问题。其二在于基因印迹丢失。初始状态多能干细胞的一个特征是整体低甲基化，在重新分化回到启动状态时会被重新甲基化，然而大多数印迹基因在重新启动的细胞中会被抹去，从而产生不良后果。

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文末小结

综上所述，人类多能干细胞在细胞治疗和其他应用方面的潜力是巨大的。超过14种疾病和损伤的细胞疗法已经或即将进入临床试验。多能干细胞技术的其他应用也在稳步推进展：包括从多能干细胞衍生出的造血干细胞治疗白血病和其他血液疾病，用于治疗肝衰竭的肝脏类器官，用于治疗肾衰竭的肾脏类器官。

虽然多能干细胞衍生产物临床应用的主要困难和挑战是巨大的，但是也有一些令人鼓舞的成功案例激励着研究的继续，数百名科学家正在一起努力着。

山中伸弥教授相信，在不久的将来，基于多能干细胞的细胞治疗技术将成为一项真正的临床选择，在全球范围内为病人带来福音。

山中大神原文：

[1] https:///10.1016/j.stem.2020.09.014