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本文由梁婷编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转发转载。 肠道菌群相关代谢物是心血管疾病（CVD）的临床潜在生物标志物。循环琥珀酸是一种由微生物和宿主产生的代谢物，其水平特别是在高血压、缺血性心脏病和2-型糖尿病中得到增加。目前，很少有研究表明肠道菌群与循环琥珀酸相关。 论文ID 原名：Elevated circulating levels of succinate in human obesity are linked to specific gut microbiota 译名：肥胖人群琥珀酸循环水平的升高与特定的肠道菌群相关 期刊：The ISME Journal IF：9.267 发表时间：2018年 通信作者：Joan Vendrell , Sonia Fernández-Veledo 通信作者单位：Unitat de Recerca, Hospital Universitari de Tarragona Joan XXIII, Institut d´Investigació Sanitària Pere Virgili, Tarragona, Spain 实验内容 1 肥胖人群的循环琥珀酸水平升高，并且与较差的代谢谱图相关 在91名肥胖和2-型糖尿病患者（队列1）队列中，肥胖患者血浆中循环琥珀酸显著高于瘦人（图1a），也有研究报道称随着BMI的增加，2-型糖尿病显著增加，这些研究结果表明循环琥珀酸水平与体质状况相关。因此，我们发现循环琥珀酸水平与BMI之间存在正相关（图1b），同时也发现循环琥珀酸水平与胰岛素、葡萄糖、稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和甘油三酯之间存在正相关（图1b）。循环琥珀酸水平也与舒张压呈正相关（R =0.386, p =0.039）。多元回归分析（R2=0.295）根据年龄和性别调整后发现BMI和葡萄糖（β=0.495，p<0.001,β=0.279，p=0.013）是循环琥珀酸水平的主要决定因素。 琥珀酸通过与SUCNR1的结合在脂肪组织中具有抗脂解作用，抑制脂肪细胞中脂肪酸的释放。研究发现循环琥珀酸水平与编码细胞内三酰基甘油降解的基因的关键酶呈现负相关，包括脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)，含水解酶域(ABHD5)和激素敏感脂肪酶（HSL）（图1c）。在分泌脂溶性因子锌-α-2-糖蛋白（ZAG）的基因编码中也发现了类似的负相关（图1c）。相反，我们发现琥珀酸水平与氢化合物（HIF-1α，是慢性炎症和肥胖障碍的关键转录因子）因子呈现正相关（图1c）。的确，琥珀酸在先天免疫方面的功能已经建立，它通过HIF-1α的稳定性增强了白介素-1β（IL-1β）的产生。然而，我们发现循环琥珀酸水平与抗炎巨噬细胞标志物（CD163）在皮下脂肪组织（SAT）中的表达相关，但不是与炎症标记物如IL-1β或MCP-1（R = 0.116 p = 0.466; R = 0.039 p =0.809）。支持了琥珀酸可能在细胞内和细胞外功能不同的观点，如之前提到的骨桥蛋白和热休克蛋白等其他应激相关因素。值得注意的是，尽管内脏脂肪组织中也发现了一些关联，但SAT中发现了更强的相关性，这表明皮下脂肪比内脏脂肪对琥珀酸更敏感。 图1 肥胖和2型糖尿病患者中循环琥珀酸水平增加。a. 瘦人、肥胖者和2型糖尿病（T2DM）患者的循环血浆水平。b. 琥珀酸水平与BMI、胰岛素、葡萄糖、HOMA-IR和甘油三酯呈正相关。c. 琥珀酸水平与SAT ATGL、SAT ABHD5、SAT HSL、SAT ZAG水平呈负相关。d. 琥珀酸水平与SAT HIF1A、SAT CD163呈正相关。SAT：皮下脂肪组织。 2 肠道菌群组成与循环琥珀酸水平相关 通过16S rRNA基因测序对肠道微生物组成进行分析，发现肥胖受试者的厚壁菌门/拟杆菌门比值升高，门和属水平的物种丰富度和微生物多样性降低。我们发现在肥胖和非肥胖个体中琥珀酸产生菌普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae）的相对丰度（37.52±3.86% vs 12.93±3.97%，p =0.0005）（36.08 9.52% vs 19.51 4.26%，p = 0.03）（图2a）。因此，血清琥珀酸水平与普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）呈正相关（R=0.465；p =0.039）。相反，琥珀酸消耗菌臭杆菌科（Odoribacteraceae）(1.58±0.68% vs 6.18±1.64%，p =0.005)和梭菌科(0.09±0.04% vs 1.02±0.36%，p=0.05)的相对丰度在肥胖人群中明显低于非肥胖人群（图2a）。其他细菌科，如副萼苔科（Paraprevotellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）或瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），也与琥珀酸代谢有关，均未发现差异。因此，肥胖受试者中(P+V/O+C)(Prevotellaceae + Veillonellaceae/Odoribacteraceae +Clostridaceae)的比例显著升高（图2b），并且与血清中琥珀酸水平呈正相关（图2c）。在属水平上，我们发现琥珀酸产生菌光岗菌属（Mitsuokella spp）在肥胖人群的粪便样本中富集，与此同时，琥珀酸消耗菌考拉杆菌属（Phascolarctobacterium spp）和臭杆菌属（Odoribacter spp）显著降低。相应的，在属水平上，特定琥珀酸产生菌/琥珀酸消耗菌的比例在肥胖个体中也明显高于非肥胖个体。 根据“漏肠”假说，肥胖个体的肠道菌群失调与细菌及其产物向体循环的易位直接相关。正如预期的那样，有关肠道通透性的一种生物标志物，连蛋白（Zonulin）的循环水平在肥胖者中显著高于非肥胖者。血清琥珀酸与连蛋白（Zonulin）呈正相关（R=0.61；p=0.011）（图2d），这表明类似于肥胖者中循环脂多糖水平的升高，肠道通透性可能与循环琥珀酸的存在密切相关。 为了进一步研究血清琥珀酸与肠道菌群的关系，我们对粪便中DNA进行了全基因组鸟枪法测序。正如前面的队列研究指出的那样，肥胖组血浆中的琥珀酸水平明显高于瘦人组；此外，我们还发现在肥胖人群中科水平的韦荣氏菌科（Veillonellaceae）显著增加（图2e），并且韦荣氏菌科（Veillonellaceae）与血浆中琥珀酸水平呈正相关（R=0.773；p<0.001）（图2f）。因此，肥胖受试者的（P+V/O+C）的基因比值较高（图2g），与血浆琥珀酸水平呈正相关（图2h）。与队列II相似，肥胖个体的连蛋白（Zonulin）水平较高，与循环琥珀酸水平呈正相关（R=0.59；p=0.0152）。 总的来说，这些数据表明尽管个体间存在异质性，循环琥珀酸水平与肠道菌群的特定成分有关。有趣的是，以前也报道过与循环琥珀酸水平相关的微生物与CVD和其危险因素有关。因此，琥珀酸消耗菌如臭杆菌和梭状芽胞杆菌，与心血管风险相关的临床参数的降低有关。相比之下，普雷沃特拉属（Prevotella）最近被认为与高血压和氧化三甲胺（TMAO）诱导的动脉粥样硬化有关。在这些方面，陈和他的同事已经证明白藜芦醇通过抑制普雷沃特拉属（Prevotella）来调节肠道微生物群，而普雷沃特拉属（Prevotella）反过来会导致循环TMAO水平的下降，该研究指出肠道菌群是一个吸引人的靶点，可用于药理学或膳食干预，以降低心血管疾病的风险。 图2 肥胖人群的肠道菌群的组成与循环琥珀酸水平有关。a. 非肥胖者和肥胖者个体中拟杆菌门和厚壁菌门的发病率百分比。b. 非肥胖者与肥胖者科水平的差异：科（Prevotellaceae+Veillonellaceae/odoribacteria+Clostridaceae）（fam(P+V/O+C)的比值。c. 琥珀酸水平与fam(P+V/O+C)比值的正相关。d. 血清琥珀酸水平与血中连蛋白（Zonulin）水平呈正相关。e. 瘦型和肥胖个体中拟杆菌门和厚壁菌门的发病率百分比。f. 血清琥珀酸水平与韦荣氏菌科（Veillonellaceae）呈正相关。g. 在队列III研究中，科水平（P+V/O+C）比率在瘦人和肥胖者之间的差异。h. 在III队列研究中，血清琥珀酸水平与log fam（P+V/O+C）比值呈正相关。 3 饮食减肥干预影响循环琥珀酸水平改变肠道菌群 为了确定饮食诱导肠道菌群的改变是否能反映循环琥珀酸盐水平的变化，我们对肥胖患者进行了为期12周的前瞻性饮食干预研究，旨在达到减肥的目的。干预后血清琥珀酸水平下降（图3a），与属和科水平物种丰富度的增加一致。虽然在属或科多样性中未发现显著差异，但我们发现厚壁菌门/拟杆菌门比率有所下降，类似于之前的饮食减肥干预研究。 根据之前的两个队列（队列II和队列III）的结果，我们发现在饮食干预后，普雷沃特拉属Prevotellaceae（17.91±6.43% vs 7.15±2.47%，p=0.019）和韦荣氏菌科Veillonellaceae（13.11±2.76% vs 3.73±1.48%，p=0.027）的相对丰度显著下降（图3b）。与在队列III中观察到的结果相比较，我们发现在饮食干预后普雷沃特拉属Prevotellaceae的发病率变化与琥珀酸水平呈现正相关（R=0.751；p =0.019）（图3c）。与此同时，fam(P+V/O+C)比值在减肥后显著降低（图3d），与琥珀酸水平的降低呈正相关（图3e）。在属水平上也有类似的观察，干预后gen(P+V/O+C)比值显著降低。 综上所述，这些结果表明短期饮食减肥干预会影响与琥珀酸代谢相关的肠道共生菌群组成。具体地说，在两个分类学水平上，琥珀酸产生菌的减少与琥珀酸消耗菌的增加，与观察到的循环琥珀酸水平的降低相关联，该结果指出循环琥珀酸作为一种新的在肥胖背景下的代谢产物。 值得注意的是，两个队列（队列II和队列IV）的联合分析证实了fam（P+V/O+C）比值与循环血清琥珀酸水平（n=38，R=0.646；p<0.001）之间呈显著正相关。多元回归分析显示，科水平琥珀酸产生菌和琥珀酸消耗菌的比率是循环琥珀酸水平的主要决定因素（R2=0.744，β=0.597；p=0.007）。尽管有很强的相关性，肠道菌群如何相互作用和琥珀酸的产生是目前未知的。此外，其他肠道菌群也可能负责琥珀酸的产生（例如，琥珀酸弧菌（Succinovibrio spp.）、瘤胃球菌属（Ruminococcus spp.）、产琥珀酸纤维杆菌（Fibrobacter succinogenes））和消耗（例如，小类杆菌属（Dialister spp.），赛氏杆菌（Phascolartobacterium succinatutes））。然而，我们的结果表明科水平（P+V/O+C）比值与循环琥珀酸水平有很强的联系。 图3 饮食干预导致的体重减轻改变了特定的肠道微生物组成，影响循环琥珀酸水平。a.最初状态和12周的饮食干预(12-wDI)后血清琥珀酸的水平。b. 血清循环琥珀酸水平在最初状态和12周饮食干预后（12-wDI）肥胖个体中拟杆菌门和厚壁菌门的发病率百分比。c. 12周饮食干预后（12-wDI）血清琥珀酸水平与普雷沃特拉属Prevotellaceae变化呈正相关。d. 最初状态和12周的饮食干预(12-wDI)后fam(P+V/O+C)比值的差异。e. 最初状态和12周的饮食干预（12-wDI）后血清琥珀酸fam(P+V/O+C)比值变化呈正相关。 4 微生物自然进化驱动循环琥珀酸水平的变化 最后，为了评估微生物群的自发进化，我们研究了19名受试者，他们都接受了在随访最初和之后2年的健康习惯咨询。我们使用宏基因组方法而不是16S测序来分析这个队列中的肠道微生物群。在随访结束时，将受试者按科水平（琥珀酸产生菌）和（琥珀酸消耗菌）比例变化不同分为两组。减少fam(P+V/O+C)的比值与琥珀酸水平明显降低相关，而fam(P+V/O+C)比例的增加与琥珀酸水平的增加相关（表1）。这些结果表明，肠道微生物组成的变化与琥珀酸循环直接相关，而体重变化无相关性。值得注意的是，琥珀酸水平的升高与葡萄糖稳态的损害是相关的，这与最近在动物模型中报道的琥珀酸产生菌与葡萄糖稳态的改善有关。确实，高琥珀酸水平与人类各种疾病（包括CVD和T2DM在内）相关。 多变量分析发现64个编码代谢酶的基因表达与fam(P+V/O+C)比值之间是有统计学意义的联系。层次聚类的宏基因组数据和科水平（P+V/O+C）比值、循环琥珀酸水平和琥珀酸相关微生物物种有很大的关联，确定了两个集群（标记为A和B在图4 a）与科水平(P+V/O+C)比值有很明显的关系（正相关和负相关分别用绿色和红色表示），这主要是反映在琥珀酸的水平上。分析普雷沃特拉属Prevotellaceae和梭菌科Clostridaceae的关系时，也证实了宏基因组的聚类，并发现了很强的反相相关关系。A组中主要的正相关基因是编码参与氨基酸运输和代谢的代谢酶的基因，而B组中主要的正相关基因是与能量产生和转换相关的基因。在这两组中都发现了与碳水化合物运输和代谢相关的基因之间的密切关系。有趣的是，亚群A1/A2和B1/B2是根据与韦荣氏菌科Veillonellaceae和梭菌科Clostridaceae的反向关联进行分离的。这些结果将fam(P+V/O+C)比值、特定肠道菌群和循环琥珀酸水平与特定的分子和代谢功能联系起来。 当我们根据fam(P+V/O+C)比值分成两组，相关的基因表达谱的差异与特定的细菌菌群相关（1组和2组）。随访2年后，在fam(P+V/O+C)比值随琥珀酸水平的增加而增加的受试者中检测到基因编码酶的增加与碳水化合物的运输和代谢相关，比如胶酸裂解酶（EC：4.2.2.2），果胶酯酶（EC:3.1.1.11）和糖基水解酶（EC:3.2.1.52）。在这些患者中，糖酵解的基因编码酶的丰度的下降与戊糖磷酸途径相关，如核苷酸激酶（EC:2.7.1.16）和转醛酶（EC:2.2.1.2）。代谢通路相关的基因与次生代谢产物相关（如琥珀酰苯甲酸-辅酶a连接酶）(EC:6.2.1.26)等，或与氨基酸转运和代谢相关的基因(如磷酸鸟苷-5-氨基咪唑酰胺核苷酸异构酶（EC:5.3.1.16）和谷氨酸合成酶（EC:1.4.1.14）)相关的基因也被修饰。有趣的是，所有这些基因都与fam(P+V/O+C)比值的关联性很强（图4a，酶名用红色）。更重要的是，将这些酶比对到京都基因与基因组百科全书(KEGG)代谢通路图上，发现中央代谢是与fam(P + V/O + C)比值相关的主要过程。其中，甾体苷水解酶和谷氨酸合成酶因其通过GABA分流途径在糖酵解激活和琥珀酸生产中的作用而备受关注。值得一提的是fam(P+V/O +C)比值与核苷酸激酶和转醛酶呈现负相关，也可以通过抑制戊糖磷酸通路促进糖酵解（图4b）。通过绘制与fam(P+V/O+C)比值正相关或负相关的主要酶图，发现其功能特征与琥珀酸代谢之间存在明显的联系。 表1 队列V的人体测量和分析特征 图4 肠道菌群相互作用、循环琥珀酸水平与代谢细菌功能的关系。a. 在64个编码代谢酶的基因与fam(P+V/O+C)比值、循环琥珀酸盐水平、普雷沃特拉属Prevotellaceae、韦荣氏菌科Veillonellaceae和梭菌科Clostridaceae之间的Spearman秩相关关系热图。热图的注释：基于KEGG数据库的代谢通路基因分类，[C]：能源生产和转换；[E]：氨基酸运输与代谢；[F]：核苷酸转运与代谢；[G]：碳水化合物运输和代谢；[H]：辅酶运输与代谢；[I]：脂质转运与代谢；[P]：无机离子转运与代谢；[Q]：次生代谢物、生物合成与分解代谢。b. 与fam(P +V/O+C)比值及KEGG代谢途径中代谢酶的正、负相关。 结 论 总之，我们的研究首次揭示了人体肠道菌群、基因组成、代谢和循环琥珀酸水平之间的紧密联系。我们目前的研究结果表明琥珀酸是一种肠道菌群代谢产物，在肥胖和代谢相关心血管疾病中具有潜在的作用，并且微生物源生物活性化合物加强了肠道菌群及其相互作用的重要性。这些代谢化合物如何影响宿主潜在的与肥胖相关的疾病，或控制肠道菌群，特别是通过增加琥珀酸消耗菌，是否可能改善肥胖患者的代谢紊乱，是未来工作中需要探讨的一些开放问题。而且，琥珀酸的寄主甚至膳食来源都不应该被忽视。
（1）综述 | Cell子刊：胆汁酸-微生物互作及对宿主代谢的影响 |
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