|
编译：A国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 土壤是抗生素抗性基因(ARGs)的重要储存地，这些基因可能会在不同的生态系统中传播，并被威胁人类和动物健康的病原体所获取。目前，缺乏关于这些基因的特性和多样性的信息，从而无法预测未来在临床环境和畜牧业中可能出现的耐药性发展。 在本研究中，我们应用功能宏基因组学在森林和草地土壤中发现了新的磺胺和四环素抗性基因。筛选土壤宏基因组文库，共发现8个未知的抗生素抗性基因。恢复的基因来自于系统遗传多样性的土壤细菌(如放线菌门,绿弯菌门或变形菌门)，编码的蛋白质对其他抗生素耐药性决定因素的识别度最低为46%。迄今为止，在针对抗生素抗性的研究中，尤其是森林土壤生态系统一直被忽略。在此，我们首次在没有接触过这些合成药物的森林土壤中检测到具有对磺胺类药物抗性的非流动态的二氢蝶酸合成酶(DHPS)基因。在山毛榉和松林土壤中共发现了三种生物分类抗性不同的耐磺酰胺的DHPS。这说明天然存在于森林土壤细菌群落中本身就具有磺酰胺抗性。除了森林土壤衍生的磺胺抗性蛋白外，我们还在草地土壤中鉴定了一种与绿弯菌门相关的DHPS。这种酶和其他回收的DHPS降低了对广泛用于食用动物生产的磺胺二甲嘧啶的敏感性。在四环素耐药性方面，确定了与主要促进因子超家族(MFS)相关的四个外排蛋白。值得注意的是，这些蛋白质之一也降低了对林可霉素的敏感性。 论文ID 原名：Discovery of Novel Antibiotic Resistance Determinants in Forest and Grassland Soil Metagenomes 译名：在森林和草原土壤中发现新的抗生素耐药性决定因素 期刊：Frontiers In Microbiology IF：4.259 发表时间：2019.03 通讯作者：Heiko Nacke 作者单位：德国哥廷根大学 实验设计 土壤样本取自德国生物多样性探索组织的森林和草原地区。计算了所有草地采样点的土地利用强度指数（LUI）。为了说明管理实践的年际变化，土地利用强度指数是从2006年到2008年（采样年）计算得出的。土地利用强度指数可以对放牧强度（通过考虑放牧的牛，马或绵羊的数量以及每个地点的放牧时间进行计算），割草频率和施肥强度进行单独分析。 抗生素耐药性筛选和序列分析基于功能的筛选是基于带有宏基因组文库的大肠杆菌克隆在含有50 mg / L卡那霉素的LB琼脂培养基上形成菌落的能力，该培养基选择了筛选载体pCR-XL-TOPO和5 mg / L四环素或250 mg / L磺胺甲恶唑。在有氧条件下于37℃孵育1–3天后形成的菌落被挑出，用于进一步研究。使用桑格测序技术，通过莱伯泰科Microsynth仪器（德国哥廷根）对源自阳性克隆的重组质粒进行测序。使用KAIJU软件对所有质粒插入片段进行分类。通过使用由国家生物技术信息中心（NCBI）和Artemis计划提供的ORF查找工具，对插入片段上的ORF进行了初步预测。随后，针对NCBI非冗余蛋白序列数据库进行了Blast搜索。此外，Resfams是最近生成的蛋白质家族数据库和相关的配置文件隐式马尔可夫模型（代表所有主要ARG类），用于序列比较。对ACLAME数据库0.4版和Gypsy数据库2.0版进行了Blast搜索，以鉴定可移动的遗传元件。此外，IS finder（数据库来自2018-09-11）用于鉴定细菌插入序列。使用差异数方法计算进化距离。 为了验证候选ORF是否编码抗生素抗性，将它们亚克隆到载体pCR4-TOPO（Thermo Fisher Scientific）中，然后引入大肠杆菌TOP10中。两个插入序列（相应的质粒，pLAEG3_tet01和pLSEG6_tet01）编码与四环素抗性基因TetR调节子家族成员相似的蛋白。在这种情况下，将编码调节剂的基因以及潜在的ARG一起亚克隆。根据生产商的说明，使用QIA快速PCR纯化试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）纯化PCR产物。随后，将脱氧腺苷添加到DNA的30个末端。促进通过TA方法克隆。然后使用QIA快速PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化DNA，并按照制造商的描述将其插入载体pCR4-TOPO（Thermo Fisher Scientific）。根据生产商的方案将所得载体转化到大肠杆菌TOP10化学感受态细胞中。 结果 1 未暴露于合成药物的森林土壤带有耐磺酰胺的DHPS 磺胺类药物是针对叶酸途径酶DHPS的合成抗菌化合物。尽管本研究中分析的所有林地都没有暴露于这些合成化合物的历史，但从山毛榉或松林土壤中回收了三个赋予磺酰胺抗性的基因AEW9_dhps01，SEW2_dhps01和SEW5_dhps01。此外，就位于SchorfheideChorin勘探区（德国东北）的森林地点（SEW2和SEW5）以及位于SchwäbischeAlb勘探区（德国西南）的森林地点（AEW9）而言，据我们所知，土壤不是暴露于分子结构类似于磺酰胺的化学物质。特别是在AEW9站点的情况下，此类化学品不太可能扩散，因为该站点属于未经管理的山毛榉林。对磺胺类药物的抗性通常由可移动的DHPS编码基因sul1，sul2或sul3介导，已在虾塘，猪场废水和粪肥等各种环境中检测到这些在临床分离物中也存在（Grape et al。，2003）。据我们所知，我们首次在此报告了森林土壤生态系统中功能性非移动性耐磺酰胺的DHPS的存在。推导的AEW9_dhps01，SEW2_dhps01和SEW5_dhps01的基因产物在全长蛋白质上与最接近的DHPS仅显示46％至58％的氨基酸序列同一性（表5）。此外，AEW9_dhps01包含替代起始密码子GTG（所有其他检测到的DHPS基因均包含起始密码子ATG）。系统发育分析表明SEW2_DHPS01与Deltaproteobacteria的推定DHPS具有同源性（图2）。然而，到目前为止，尚未分析这种推定的酶是否代表可以赋予对磺酰胺抗性的功能性DHPS。与SEW2_DHPS01相比，AEW9_DHPS01与具有确认的磺酰胺抗性的DHPS具有较低的同一性（46％），但在系统发育树中与该隶属于食物谷菌目（Victivallales）的酶分开分支（图2）。在森林土壤中鉴定出的剩余的赋予磺酰胺抗性的酶SEW5_DHPS01与Alphaproteobacteria的DHPS最相似（同一性为58％）。令人惊讶的是，对于包含AEW9_dhps01，SEW2_dhps01和SEW5_dhps01的插入片段，没有预测到可移动的遗传元件。这表明定植在森林土壤生态系统中的不同细菌菌群都带有DHPS，而DHPS对磺酰胺的抑制作用自然不敏感。此外，我们的结果表明，森林土壤中的DHPS在大肠杆菌TOP10中具有高水平的抗性（图1、3），因此也可能在临床上与肠杆菌科细菌有关。由于磺胺类药物用于治疗人的胃肠道或泌尿道感染，属于最普遍销售和使用的兽用抗生素，动员和传播迄今未知的基因赋予对这些合成化合物的抗性将产生严重后果，尤其是对于动物部门。特别是SEW2_DHPS01和SEW5_DHPS01对磺胺二甲嘧啶显示出高水平的抗性（图1），广泛用于食用动物生产中。 图1 由SEW2_dhps01，SEW5_dhps01，AEW9_dhps01和AEG2_dhps01介导的对磺胺类抗生素的耐药性。将5μL起始OD600为0.5的连续稀释的大肠杆菌TOP10培养物点样到补充1000mg / L磺胺二甲嘧啶（+ SMZ），250 mg / L磺胺甲恶唑（+SMX），250 mg / L磺胺嘧啶的Iso-Sensitest琼脂平板上（+SDZ）或500 mg / L磺胺异恶唑（+ SOX）。还包括未添加磺酰胺的Iso-Sensitest琼脂平板（对照）。考虑了带有克隆载体pCR4-TOPO，pCR4_SEW2_dhps01，pCR4_SEW5_dhps01，pCR4_AEW9_dhps01或pCR4_AEG2_dhps01的大肠杆菌TOP10培养物。 2 发现属于绿弯菌门的草地土壤衍生DHPS 最近，在受污染的印度河沉积物中发现了第四个可移动的磺酰胺抗性基因（sul4），其编码与叶绿藻门的代表在系统发育上相关的DHPS。该基因的侧翼是一个ISCR元件，该元件已知参与水平基因转移。在这项研究中，我们鉴定了一种酶（AEG2_DHPS01），其对磺酰胺类药物的敏感性降低（图1和表6），在肥沃的草地土壤中显示出与绿弯菌门（Chloroflexi）的DHPS相似。 AEG2_DHPS01与厌氧科成员的DHPS共享76％的序列同一性（表5），并且在系统树中与包括sul4在内的不同绿弯菌门 DHPS簇在一起（图2）。关于携带AEG2_dhps01的插入物，未鉴定出潜在地参与叶酸合成的基因。取而代之的是，AEG2_dhps01侧翼是一个ORF，其编码一个与原始蛋白N0（复制因子Y）-厌氧细菌的超家族2解旋酶的相似性低（23％一致性）的推定基因产物（附表S2）。由于解旋酶在核酸底物的复制，重组和修复中起主要作用，因此该基因产物可能有助于绿弯菌门和其他细菌类群之间的水平基因转移。除了潜在的解旋酶基因外，AEG2_dhps01的两侧还带有一个ORF，该ORF编码一种与厌氧细菌的假定蛋白相似的基因产物。对带有AEG2_dhps01的完整插入片段的分类学分析证实，其原始宿主属于绿弯菌门（补充表S1）。因此，除Sul4以外，AEG2_DHPS01代表了迄今为止唯一鉴定出的DHPS，显示出其对磺胺类药物敏感性降低（表6），而磺胺类药物隶属于叶绿藻。为了分析耐磺酰胺性是否是屈挠弯曲菌的共同特征，在以后的调查中应分析属于该门的分离株对合成药物的敏感性。除磺酰胺类药物外，对于携带亚克隆DHPS基因的大肠杆菌TOP10，未发现对其他测试抗生素的敏感性降低（图3和表6）。 图2 基于SEW2_DHPS01，SEW5_DHPS01，AEW9_DHPS01，AEG2_DHPS01和其他细菌DHPS氨基酸序列的相邻连接系统树。除了在本研究中确定的DHPS外，还考虑了它们最接近的相关参考数据库条目，耐流动性耐磺酰胺的Sul1，Sul2，Sul3和Sul4，以及其他DHPS。分支点显示了基于1,000个重复的引导值。在括号中用已标识的分类单元名称和登录号注释分支。绿色段表示DHPSs属于绿弯菌门，假单胞菌，细菌。 3 减少四环素和林可霉素敏感性的外排蛋白 我们鉴定了四个质粒，pLAEG3_tet01，pLSEG6_tet01，pLSEG8_tet01和pLSEG8_tet02，赋予外排介导的四环素抗性。所有这些质粒均编码与主要辅助超家族（MFS）外排蛋白相似的基因产物。 MFS外排系统广泛分布在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。中国土壤中通过功能性宏基因组学鉴定的24个四环素抗性基因中的21个与MFS相关。由这21个基因编码的蛋白质与最近的相关参考数据库条目的同一性≥78％。相比之下，在这项研究中确定的四分之三的MFS代表与其最接近的相关蛋白具有≤67％的同一性（表5）。除了MFS代表，还有两个插入序列（相应的质粒pLAEG3_tet01和pLSEG6_tet01）编码与TetR调节子家族成员相似的蛋白（表5）。这些调节剂与抗生素抗性相关，并且已知控制MFS成员的表达。值得注意的是，质粒pLtetSEG8_02的插入片段编码的蛋白与核酸内切酶相似（附表S2），这可能有助于水平基因转移。在此，对于产生重组MFS的大肠杆菌克隆，未检测到对利福平的抗性（图3）。然而，携带质粒pCR4_AEG3_tet01ab的四环素抗性克隆显示出对林可霉素的敏感性降低（图3和表6）。该质粒编码的基因产物AEG3_Tet01a与未经培养的细菌产生的土壤衍生MFS具有98％的同一性（表5），该细菌赋予了对氯霉素的抗性。 图3 携带土壤衍生基因的大肠杆菌TOP10的抗生素敏感性概况与抗生素抗性有关。将基因亚克隆到质粒载体pCR4-TOPO中。使用肉汤微稀释法确定抗生素的MIC，相对于带有克隆载体pCR4-TOPO的大肠杆菌TOP10，其MIC增加。 CAX，头孢噻肟; CHL，氯霉素； ERY，红霉素； GEN，庆大霉素; LIN，林可霉素； RIF，利福平； SDZ，磺胺嘧啶； SMX，磺胺甲基异恶唑; SMZ，磺胺二甲嘧啶; SOX，磺胺异恶唑; TET，四环素； TYL，泰乐菌素。 讨论 评论
|
|
|
