【原】南京林业大学 | AEM：土壤微生物群落对周期性接种反应的演替

编译：微科盟达达兔，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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导读

重复接种是微生物接种在植物和土壤中持续发挥作用的有效方法。到目前为止，单次接种对土壤中土著微生物群落的影响已有研究，但是周期性接种对土著微生物的演替影响尚不清楚，会影响多长时间以及影响的程度尚不明确。本研究研究了植物生长、土壤功能和土壤中土著细菌群落对单一或混合接种时磷酸盐和固氮细菌的动态响应。与单一菌剂接种相比，混合菌剂接种对植物生长和土壤养分有更好的促进作用。但是，接种菌剂的有效性没有随接种次数的增加而增加，移栽到不同地点后有效性没有得到维持。研究人员发现细菌群落组成对微生物接种剂反应的三种变化模式（成倍增加，成倍减少，和恢复）。周期性接种影响了土壤微生物群落的演替，主要受土壤pH和硝酸盐的变化驱动，在整个研究过程中形成了三种主要的聚类类型。单一菌剂和混合菌剂对土壤pH和C/N的变化有短暂的调节作用，最终微生物群落对后续接种表现出恢复的作用。所以，重复接种的必要性应重新考虑，不同的微生物接种剂对土著微生物群落演替有不同的影响。

论文ID

原名：Succession of the Resident Soil Microbial Community in Response to Periodic Inoculations

译名：土壤微生物群落对周期性接种反应的演替

期刊：Applied and Environmental Microbiology

IF：4.016

发表时间：2021.2

通讯作者：洑香香

通讯作者单位：南京林业大学林学院

实验设计

1、采样地点及准备

苗圃地点是在中国南京白马（31°35'N, 119°E）的一个半自动植物生长装置中，生长地点位于中国台州（32°37的N, 119°98 E）江苏中医药科技园区。这些地点年降雨量1037 mm，日照2146小时，年平均气温15.4℃左右。白马的土壤特性是pH 5.98，总碳18.9 g/kg，总氮1.61 g/kg，总磷是0.42 g/kg，速效氮是12.68 mg/kg。台州土壤性质是土壤pH值7.31，总碳12.72g/kg，总氮0.88g/kg，总磷是0.45 g/kg，速效氮是88.35 mg/kg。

实验处理为M：用芽孢杆菌（B. megaterium）接种；C：用褐球固氮菌（A. chroococcum）接种；MF：用芽孢杆菌（B. megaterium）和荧光假单孢菌（P. fluorescens）混合接种；CB：用褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种；MFCB：用芽孢杆菌（B. megaterium）、荧光假单孢菌（P. fluorescens）、褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种。

 

2、试验设计和样品采集

采用完全随机区组设计，分为5接种类型（M、MF、C、CB、MFCB）， 3个区组。本研究将未接种样品作为对照。每个处理有60个青钱柳幼苗。

在每个区块处理中，随机采集5个0-10 cm的土壤样品，均匀混合到一个样品中，得到三个区块的3个样品。采样时间是第一次接种的前一天（0天），第一次接种后10天（I-10），第一次接种后30天（I-30），第一次接种后45天（I-45），第二次接种后45天（II-45），第三次接种后45天（III-45），和第四接种后45天（IV-45）（图6）。

图6 微生物接种、土壤取样和植物生长测量的时间表。试验主要于2018年（接种期）在南京进行。2019年（移栽期）移栽台州。

 

3、植物生长测量

分别在第一次接种前和接种后45、90、135、180、360和540天测定健康苗的苗高和地径（图6）。

 

4、土壤生物化学性质

用pH电极测定土壤pH值，用元素分析仪测定总碳和总氮含量。采用Tabatabai和Bremner方法测定酸性磷酸酶活性。采用乙炔还原法测定土壤固氮酶活性。

 

5、DNA提取和Illumina MiSeq测序

根据制造商的规程，使用NucleoSpin®Soil DNA试剂盒提取土壤总DNA（0.5 g土壤）。采用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计测定最终DNA浓度和纯度。利用PCR扩增引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）扩增16S rRNA基因的V4高变区。

 

6、统计分析

利用SPSS软件进行统计分析，包括植物生长和土壤养分变量的多重比较。采用双因素方差分析（ANOVA）方法分析了不同接种剂和不同采样时间对白马地区株高和地径的影响。采用单因素方差分析评价不同处理对台州市株高和地径的影响。基于Bray-Curtis进行主成分分析（PCoA）。采用线性判别分析（LDA）估计各指标的效果评分。

结果

1、微生物接种剂对青钱柳（Cyclocaryapaliurus）生长的影响

在接种期（白马苗圃）和移植期（台州苗圃）对青钱柳的生长指标进行动态监测。在白马苗圃，只有MFCB处理在第一次接种45天后显著提高了幼苗高度，在此期间没有发现地面直径有显著提高。第二次接种后，结果表明，添加芽孢杆菌和荧光假单胞菌的处理即MF和MFCB处理，株高生长得到改善（图1a，d），但在其它处理中未发现明显的影响。在台州苗圃，MF和MFCB处理显著提高了株高，但是接种苗与未接种苗的地径差异不显著。从高度相对生长率（RGRh）和地径相对增长率（RGRd）来看，在接种期间特别是MF，CB和MFCB处理增加了白马苗圃的青钱柳的高度相对生长率和地径相对增长率，而在移植期间，微生物接种的影响非常有限（图1c，f）。

图1 白马地点青钱柳苗高、地径动态（接种期）（a、d）。台州（移植时期）青钱柳最终高度（b）和地径（e）。白马和台州的高度相对增长率（c）和地径（f）。采样天数分别为第1、2、3、4次接种后45天。M：用芽孢杆菌（B. megaterium）接种；C：用褐球固氮菌（A. chroococcum）接种；MF：用芽孢杆菌（B. megaterium）和荧光假单孢菌（P. fluorescens）混合接种；CB：用褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种；MFCB：用芽孢杆菌（B. megaterium）、荧光假单孢菌（P. fluorescens）、褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种。CK：不接种。

 

2、土壤生物化学特性

在接种期，分别在6个时间点（I-10、I-30、I-45、II-45、III-45和IV-45）采集土壤，测定土壤的生化性质。第一次接种后，在10-90天内，接种土壤的速效养分与对照显著不同。土壤pH值在前10天和后90天均低于对照处理。接种时间对土壤固氮酶和酸性磷酸酶活性有显著影响。

 

3、基于16S rRNA基因测序的细菌多样性研究

在对115个样本进行等量的二次采样后，共获得10978个OTUs，识别率为97%，每个样本的范围为1952到2932个OTUs。所有处理均获得了近乎完整的细菌群落多样性采样。接种对I-45后的Shannon和Simpson指数无显著影响，但是在最初的45天，对Ace和Chao1指数有显著影响。在初始阶段，不同微生物类群的影响各不相同。与CK处理相比，接种四种菌株（MFCB）处理和两种NFB（CB）处理使I-10的Simpson值增加，而PSB处理（M和MF）的Ace指数较低（P<0.05）。 

 

4、微生物反复接种下土著细菌群落组成的变化

前11个门的相对丰度约占总群落的96％。实验土壤中的细菌序列大部分属于变形菌（Proteobacteria）（42-54%）、拟杆菌（Bacteroidetes）（5-10%）、放线菌（Actinobacteria）（5%）和酸杆菌（Acidobacteria）（5-21%）；其余的（16-20%）属于厚壁菌（Firmicutes）、绿弯菌（Chloroflexi）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、浮霉菌（Planctomycetes）和环单胞菌（Armatimonadetes）。前50个科在时间变异上对周期性接种的反应表现出3种不同的变化模式：恢复性（a和c）、拮抗性（b）和协同性（d）（图2）。应该注意的是，在第一次接种后（I-10、I-30和I-45）的前45天，处理间的差异显著。

 

图2 周期接种，细菌群落在科水平（前50名）的热图。黑方框表示各时间点处理间差异的统计学意义。a、b和c显示了不同采样时间点细菌类群的不同变化模式。采样天数为0d：微生物接种前一天；I-10、I-30、I-45分别为首次接种后10天、30天、45天;II-45、III-45和IV-45：分别在第二次、第三次和第四次接种后45天。M：用芽孢杆菌（B. megaterium）接种；C：用褐球固氮菌（A. chroococcum）接种；MF：用芽孢杆菌（B. megaterium）和荧光假单孢菌（P. fluorescens）混合接种；CB：用褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种；MFCB：用芽孢杆菌（B. megaterium）、荧光假单孢菌（P. fluorescens）、褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种。CK：不接种。

 

5、微生物重复接种对细菌整体群落结构的影响

在OTU水平上基于Bray-Curtis差异进行的PCoA排序表明了实验过程中土壤细菌群落的演替情况（图3a）。为进一步研究接种土壤与未接种土壤随时间的变化，利用PCoA中的Bray-Curtis差异进行分型分析（图3b和c）。图3b和图3c描述在每个时间点上簇类型的组成，表明与不接种处理相比，重复接种改变了群落的演替。线性判别分析（LDA）揭示了接种土壤中3种聚类类型（接种0-10天、接种30-45天、接种90-180天）门丰度的差异（图3d）。研究人员还测定了土壤性质（碳，氮，硫，碳/氮，硝酸盐，pH和酶活性）来解释接种土壤中细菌群落的变化（图4）。

 

图3 不同土壤管理方式下细菌群落结构随时间的变化。（a）土壤中土著细菌群落的演替。（b）未接种土壤在所有时间点上的细菌群落群集（PCoA图）及其支配性（bar图）。不接种0-10天和不接种30-180天表明，从类型分析中得出的两种主要的未接种样品集。（c）所有时间点接种土壤演替中的细菌群落聚集及其优势。根据类型分析，接种0-10天、接种30-45天和接种90-180天表示接种样品的三个主要聚集。（d）通过线性判别分析（LDA）发现接种土壤中3个类群的门丰度存在差异。采样天数为0d：微生物接种前一天；I-10、I-30、I-45分别为首次接种后10天、30天、45天;II-45、III-45和IV-45：分别在第二次、第三次和第四次接种后45天。M：用芽孢杆菌（B. megaterium）接种；C：用褐球固氮菌（A. chroococcum）接种；MF：用芽孢杆菌（B. megaterium）和荧光假单孢菌（P. fluorescens）混合接种；CB：用褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种；MFCB：用芽孢杆菌（B. megaterium）、荧光假单孢菌（P. fluorescens）、褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种。CK：不接种。

图4 冗余分析说明了环境因素对所有处理下细菌群落和前10个科演替的影响。采样天数为0d：微生物接种前一天；I-10、I-30、I-45分别为首次接种后10天、30天、45天;II-45、III-45和IV-45：分别在第二次、第三次和第四次接种后45天。

 

6、群落变化的途径由单一或混合微生物接种剂瞬间调节

由于II-45、III-45和IV-45的细菌群落差异小于最初的45天，所以我们选择了最初45天和最后45天的5个时间点（图5）来评估不同接种类型对土壤中土著细菌群落的影响。在5个时间点上，群落类型分为4类（1、2、3和4型），群落由1型向4型的变化路径因处理的不同而不同。混合菌株（MF，CB，MFCB）处理的接种途径为1-2-4型，单一菌株处理（M，C）是1-3-4型（图5）。

对土壤因子进行分析，来确定潜在的非生物参数对微生物群落随时间演替影响（图5）。无机氮（硝态氮和铵态氮）、固氮酶活性和酸性磷酸酶活性是影响微生物群落结构变化的主要因素，而土壤pH、C/N比和硝酸盐含量是在I-30单一菌剂接种和混合菌剂接种处理之间差异的主要因素。

 

图5 I-10、I-30、I-45和IV-45不同接种条件下细菌群落结构的时间变化分型分析。从类型1到类型4的不同路径识别：类型1-2-4（处理MF、CB和MFCB）或类型1-3-4（处理M和C）。柱状图显示了单一、复杂、单一的变化模式，即在五个采样时间点存在四种聚类。采样天数为0d：微生物接种前一天；I-10、I-30、I-45分别为首次接种后10天、30天、45天;II-45、III-45和IV-45：分别在第二次、第三次和第四次接种后45天。M：用芽孢杆菌（B. megaterium）接种；C：用褐球固氮菌（A. chroococcum）接种；MF：用芽孢杆菌（B. megaterium）和荧光假单孢菌（P. fluorescens）混合接种；CB：用褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种；MFCB：用芽孢杆菌（B. megaterium）、荧光假单孢菌（P. fluorescens）、褐球固氮菌（A. chroococcum）和巴西固氮螺菌（A. brasilense）混合接种。CK：不接种。

讨论

1、植物生长和土壤功能对重复接种的响应

土壤中有益微生物与植物的根系相互作用，影响植物对生态环境的适应性。但是，土地集约利用可能会削弱这些有益的影响，从而使植物应对生物和非生物胁迫的能力降低。我们发现，在最初的10-90天，周期性接种主要增加了土壤速效养分。尽管在最后两次采样时MFCB处理和CB处理的优势明显，但是接种的好处一般会随着时间的推移而减少。这表明，在调查期间，微生物接种剂对土壤功能的影响是短暂的，并不持久。需要注意的是，土壤的变化与根际土壤的变化不同，而且这些变化也会反过来影响微生物群落。此外，最后一个时间点的土壤养分含量呈下降趋势可能是因为季节变化和植物对养分的吸收。之前的一些研究也表明了接种微生物菌剂可以增强植物养分吸收促进植物生长和生物量积累。

 

2、接种次数和类型影响细菌群落的组成和演替

自然条件下微生物入侵和人为的微生物入侵通常都是从主导微生物种群开始的，即使最终引入的种群可能减少，但是入侵的微生物也会在土壤土著微生物群落上留下痕迹。此外，关于引入植物促生长根瘤菌（PGPR）的研究，以往都是评价它对根际微生物群落的影响，很少关注它对土壤群落变化的影响。为了解决这个问题，研究人员评估了重复接种（非原生）对土壤土著细菌群落的影响程度和持续时间。在重复接种中，细菌群落组成由三种变化模式（成倍增加、成倍减少和恢复），其中处理间57%的显著变异发生在接种的最初45天之内。

土壤养分的变化和细菌群落的变化一致。土壤土著微生物群落对周期性接种引起的微生物干扰有较高的恢复能力，但没有抵抗能力。PCoA分析、类型分析和两两相关分析表明，群落间的差异在最后90天内呈下降趋势。这表明，在反复接种的干扰下，土著微生物群落具有恢复能力。

 

3、微生物接种剂应用过程中形成土著微生物群落的基本因素

有益微生物接种对土壤化学因子（比如硝酸盐和pH值）的影响是解释土著微生物群落随时间变化的主要因素。研究表明，土壤pH显著改变了微生物的二次演替轨迹。在接种1次和4次后，接种处理的土壤pH值与未接种处理有显著差异，这证实了之前的结论。目前研究表明，第一次接种后，和对照处理相比无机氮的含量显著增加。

在本研究中，变形菌（Proteobacteria）拟杆菌（Bacteroidetes）在接种后的45天增加，这个时期也是土壤养分快速变化的时期。蓝藻（Cyanobacteria）是新发现的有益微生物，它具有调控氮含量的能力和对施肥敏感的能力，而衣原体（Chlamydiae）和疣微菌（Verrucomicrobia）对土壤水分和时间（季节变化）敏感。绿弯菌（Chloroflexi）和芽单苞菌（Gemmatimonadetes）在旱季土壤中富集。

不同菌剂的混合接种可以促进植物生长，提高土壤养分含量，因此这一方法得到推广。本研究中，植物生长对混合菌剂MFCB处理有强烈的偏好，在整个接种期，MFCB处理的株高和地径最大。有人提出，混合接种可以产生协同作用，刺激物理或生化活动，同时提高微生物活力，从而使土壤和植物的相互作用增强。在本研究中，第一次接种30天后，不同的接种剂（单剂/混合剂）瞬间调节了土著群落的变化。土壤pH值与C/N比是这种影响的主要因素。

结论

总之，重复接种不能使微生物菌剂的效益提高到理想的条件下，移栽到不同地点对植物生长的有益影响也不能保持。因此，重复接种的必要性需要再考虑。土壤微生物群落对于重复接种表现出恢复力特性，但没有表现出抗性作用。研究表明，土壤微生物群落的变化主要反映了接种剂的初始干扰，部分解释了土壤养分和植物生长的变化。土壤细菌类群对微生物接种剂的响应取决于接种剂类型（PSB或NFB）。在群落演替过程中，接种处理和不接种处理显著不同，这导致了不同群落组成的变化，从而为了解土著微生物与入侵者之间的相互作用提供了新的视角。土壤pH和硝态氮含量是影响土著群落演替的主要因素。单一菌剂和混合菌剂均对土壤pH和C/N比值的变化有明显的调节作用。随着时间的推移，细菌群落显示出高度的恢复能力。

评论

在植物-土壤系统中引入有益微生物是改善作物产量和土壤环境的一种环境友好方法。许多研究已经揭示接种对根际微生物群落的影响，但是很少有人知道定期接种对土壤功能的有效性。此外，重复接种对土著微生物群落的持续影响尚不清楚。为保持微生物接种剂对植物和土壤的有益作用，重复接种是一种很有效的方法。到目前为止，单次接种对土壤中土著微生物群落的影响已有研究，但是定期接种对土著微生物的演替影响尚不清楚，会影响多长时间以及影响的程度尚不明确。本研究研究了植物生长、土壤功能和土壤中土著细菌群落对定期单一或混合接种时磷酸盐和固氮细菌的动态响应。与单一菌剂接种相比，混合菌剂接种对植物生长和土壤养分有更好的促进作用。但是，接种菌剂的有效性没有随着接种次数的增加而增加，移栽到不同地点后有效性没有得到维持。对微生物接种剂的反应，研究人员发现细菌组成的三种变化模式—成倍增加，成倍减少，和恢复。周期性接种影响了土壤微生物群落的演替，主要受土壤pH和硝酸盐的变化驱动，在整个研究过程中形成了三种主要的聚类类型。单一菌剂和混合菌剂对土壤pH和C/N的变化有短暂的调节作用，但是最终微生物群落对后续接种表现出恢复的作用。所以，重复接种的必要性应重新考虑，不同的微生物接种剂对土著微生物群落演替有不同的影响。最后，研究人员得出结论，初始接种对整个系统的影响更为重要，土著微生物群落对后续接种有恢复性作用，没有抗性作用。

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