【原】科研| ENVIRON POLLUT：雄性斑马鱼长期接触双酚S会加重非酒精性脂肪肝

微科享 2021-04-19

展开全文

编译：荔枝，编辑：谢衣、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

导读

环境化学物质暴露被认为是非酒精性脂肪肝(NAFLD)发生的危险因素。双酚S（BPS）, 被广泛应用于众多的消费产品中，可扰乱肝脏的脂质代谢。本研究通过半静态暴露试验，在授精后3小时至120天，分别将斑马鱼暴露于1,10和100 μg/L的BPS中，检验长期接触BPS是否会导致肝纤维化和肝炎。结果显示，120 天的BPS接触提高了血浆天门冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活性，增加了三酰基甘油(TAG)和总胆固醇水平，甚至诱导肝细胞凋亡和纤维化。30天BPS接触的斑马鱼经过90 天的净化期后，肝脏脂质积累得到恢复，从而提示长期接触BPS可促进单纯性脂肪变性向非酒精性脂肪性肝炎的发展。此外，BPS暴露120 天可通过提高srebp1、acc、fasn和elovl6的转录水平，促进TAG和无脂毒性脂肪酸的合成，并通过增加未折叠蛋白反应(UPR)基因(perk, hsp5, atf4a, ddit3)的表达水平诱导内质网应激(ER)，然后刺激两个关键的自噬基因(atg3, lc3)和炎症基因(il1b, tnfα)的表达。这提示BPS可通过激活UPR的PERK-ATF4a通路诱导脂肪性肝炎的发生。目前收集到的数据表明，环境污染物引起的内质网应激和UPR的激活可能引发男性NAFLD的发展。总的来说，本研究为了解代谢紊乱化学物质对健康的不利影响提供了新的视角。

论文ID

原名：Long-term bisphenol S exposure aggravates non-alcoholic fatty liver by regulating lipid metabolism and inducing endoplasmic reticulum stress response with activation of unfolded protein response in male zebrafish

译名：雄性斑马鱼长期接触双酚S会通过调节脂质代谢和激活未折叠蛋白反应来诱导内质网应激反应而加重非酒精性脂肪肝

期刊：Environmental Pollution

IF：5.714

发表时间：2020.4

通讯作者：张晓娜

通讯作者单位：中国海洋大学，海洋生命科学学院

实验设计

雄性和雌性斑马鱼被放在不同的水箱里，水箱里充入空气，14小时光照/10小时暗光周期，水温保持在28±1℃。饲养用水每天更换一次，用刚孵化的盐水虾喂食斑马鱼，每天两次。四周后，收集活得胚胎，雄性：雌性=2：1，3h内进行BPS暴露试验。将斑马鱼胚胎随机分配到5个玻璃烧杯中，进行不同BPS浓度的长期暴露试验[1 μg/L BPS (BPS1), 10 μg/L BPS (BPS10), 和100 μg/L BPS(BPS100) ]，一个空白对照，一个溶剂对照。暴露期间，每天更换三分之二的暴露溶液。BPS处理30天后，分别从1 μg/L和10 μg/L的 BPS处理组中取出130条幼鱼转移到不含BPS的水中，进行90天的净化期。受精后第五天，斑马鱼喂养在1.5L溶液中，受精后20天，喂养在4.5 L溶液中；受精后30-120天，喂养在40 L溶液中。每组喂食等量的鱼食，以确保在5分钟内可以吃完。采样前，将斑马鱼禁食24小时。雌性斑马鱼接触120天的BPS后，其肝脏中未观察到TAG水平升高或脂质过度积累现象。因此，只有雄性斑马鱼被用来研究BPS对NAFLD的影响。BPS处理120天后，从尾静脉取血，每组四个平行。所有血液样本，113g，离心10min，取上清液， -20℃储存，用于生化分析。手术切除肝组织，标本用于组织病理学分析。用于生化分析和RNA提取的样本保存在液氮中。所有血浆样本在0.65%生理盐水中稀释三次。TAG和TC的浓度（mmol/L），ATL和AST的活性（U/L）用试剂盒测定。之后进行肝脏组织学分析，来自同一肝脏的3张切片分别用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)、Oil Red O和picro-sirius Red染色。第一张切片用乙醇醚固定液固定30 s，用蒸馏水冲洗，HE染色。第二张用4%多聚甲醛固定30秒，用蒸馏水冲洗。60%异丙醇洗涤1 min, 0.3%Oil Red O染色10 min。用60%异丙醇和蒸馏水洗涤后，用HE复染。第三张切片用乙醇醚固定液固定30 s，用picro-sirius red标准程序染色。HE染色和Oil Red O染色的载玻片在显微镜下观察, 用偏光显微镜观察picro-sirius Red染色片。此外，将120天BPS处理后的雄性斑马鱼肝脏在2.5%戊二醛溶液中于4℃固定24小时。样品用BPS洗涤三次，经乙醇脱水后嵌入环氧树脂包埋剂。肝脏被切成80-85纳米厚度进行电子显微镜观察。采用TDT介导的TUNEL染色方法，评价肝细胞凋亡活性。每组随机取4个鱼肝进行TUNEL染色。从肝脏组织中提取总RNA，通过1μg RNA逆转录合成cDNA，并进行实时荧光定量PCR。根据GenBank中斑马鱼的序列，确定了目标基因（srebp1, acc, fasn, elovl6, cpt1aa, cpt2, hsp5, perk, eif2α,atf4a, ddit3, cd154, ire1, xpb1, mapk8b, atF6, nf-kb, ikk, il1b, tnfα, lc3, atg3）和内参基因（β-actin，elf1）的引物，并进行测定。采用SPSS 19.0等进行数据统计分析。所有分析在0.01< p < 0.05(用*标记)时为显著，在p < 0.01(用**标记)时为高度显著。

实验结果

1、雄性斑马鱼血浆和肝脏的脂类指标

试验组BPS处理120天后，不同BPS浓度均导致血浆中TAG水平显著升高[F = 46.373，p= 0.000; 图. 1(a)]。1和100 μg/L BPS显著增加TC水平，而1和10 μg/L BPS增加游离FAs含量。与此相反，100 μg/L BPS可降低雄性斑马鱼血浆游离FAs水平[F=29.030, p=0.000和F=66.492, p=0.000; 图. 1(b)和(c)]。为了评价BPS对男性肝脏的损伤或疾病的影响，测定了血浆中AST和ALT的活性。如图1(d)和(e)，与对照组相比，BPS处理组血浆中AST（F=227.965, p=0.000）和ALT（F=4.814，p=0.034）活性显著增加，说明长期接触BPS对雄性斑马鱼肝功能造成损害。此外，在雄性斑马鱼肝脏中，1和10 μg/L BPS组的TAG水平显著升高（F=14.711，p=0.000），而TC含量仅在100 μg/L BPS处理中显著增加（F=4.113，p=0.032）。

图1. 120天 BPS处理对雄性斑马鱼血浆TAG (a)、TC (b)、游离FAs (c)浓度、血浆AST (d)和ALT (e)活性、肝TAG (f)和TC (g)水平的影响。从受精后3小时到受精后120天，斑马鱼暴露于1 μg/L (BPS1)、10 μg/L (BPS10)和100 μg/L (BPS100) 的BPS中。数据用mean ± SD表示（n=4）。与控制组相比，*0.01< p < 0.05，**p < 0.01

2、 雄性斑马鱼肝脏组织病理学研究

如图2所示，对照组肝细胞排列规则，大小正常，细胞边界清晰，HE及Oil Red O染色后肝内脂质积累较少。HE染色后，与未被BPS处理的斑马鱼相比，1 μg/L的BPS处理组的肝脏中出现桥接样坏死（蓝色箭头所示）；10 μg/L和100 μg/L的BPS处理组中肝细胞出现膨胀现象（红色箭头所示）。Oil Red O染色后，BPS处理组出现红色染色，提示肝脏内存在大量脂滴。尤其在100 μg /L BPS处理的雄性组中，脂滴的数量更多。值得注意的是，肝脏切片picro-sirius Red染色显示所有BPS处理组均出现纤维化(黑色箭头)。

图2. 受精120天后雄性斑马鱼肝脏切片的代表性组织学显微照片。肝脏切片同时用HE染色（放大40×），Oil Red O染色（放大40×），sirius red染色（放大20×）。从受精后3小时到120天，斑马鱼暴露于1 μg /L (BPS1)、10 μg /L (BPS10)和100 μg /L (BPS100) 的BPS中。蓝色箭头、红色箭头和黑色箭头分别表示桥接性坏死、脂质积聚或非核细胞区域和纤维化。SC：溶液对照组。比例尺=100μm。

3、 BPS暴露对肝组织凋亡的影响和电镜分析

采用TUNEL染色法检测细胞凋亡，TUNEL阳性核染为褐色，正常核染为蓝色。如图3(e)所示，与对照组相比较，可见细胞凋亡核（以凋亡细胞百分比来评估）在所有BPS处理组中显著增加（F=21.163,P=0.000）。图3(g) 说明了从受精3小时到120天，100 μg/L BPS处理下，雄性斑马鱼肝细胞的超微结构。结果表明，对照组雄性斑马鱼肝细胞器结构完整，肝细胞无病理变化（f）。而在100 μg/L BPS处理组中，斑马鱼肝细胞出现明显的结构异常，细胞器溶解，细胞质中出现自噬体。

图3. BPS暴露120天对雄性斑马鱼肝脏的凋亡和超微结构的影响。无BPS（SC），1 μg/L（BPS1）,10μg/L（BPS10）,100μg/L（BPS100）四组处理斑马鱼从3小时到120天。TUNEL法检测细胞凋亡，TUNEL阳性细胞细胞核呈褐色。(a)代表的雄性斑马鱼肝脏溶剂对照组，(b)、(c)和(d)代表的雄性斑马鱼肝脏1,10和100μg/L的BPS处理组。比例尺=20μm。每组共观察2个放大40高倍的切片，计算褐色的TUNEL阳性肝细胞数。细胞凋亡率用图(e)表示。数据用mean ± SD表示（n=4），与溶剂对照组(SC)相比，**p < 0.01。用透射电子显微镜(TEM 6000 x)观察雄性肝细胞超微结构的变化,比例尺= 2μm。(f)和(g)表示对照溶剂和100μg/L的BPS处理下的肝脏超微结构模式。M：线粒体；N：细胞核；S：自噬体。

4、经30天BPS处理和90天净化处理后，雄性斑马鱼血浆和肝脏的组织学指标和脂质指标

尽管在1和100 μg/L BPS处理的的雄鱼肝脏中检测到脂质积累。但是经过90天的净化处理后，两组肝脏组织结构良好，细胞核突出，均未见明显的脂滴及纤维化（图.4a）。如图4(b)所示，经过30天BPS处理和90天净化后，在雄性斑马鱼的肝脏和血浆中，TAG（肝脏：F=0.926,P=0.431;血浆：F=4.012,P=0.062）或TC（肝脏：F=1.641，p=0.247；血浆：F=1.889，p=0.206）的水平没有明显的变化, 但在1 μg/L和100 μg/L BPS处理组中，游离FAs含量均显著下降（肝脏：F=17.694,P=0.001;血浆：F=125.605，p=0.000）（图4b）。

图4.（a）经过30天BPS处理和90天净化后，雄性斑马鱼肝脏切片的典型组织学照片。肝脏切片同时用HE染色（放大40×），Oil Red O染色（放大40×），sirius red染色（放大20×）。将斑马鱼暴露于1 μg/ L (BPS1)和100 μg/ L (BPS100) BPS中30天，然后在干净的水中进行90天的净化。（b）将斑马鱼暴露于1 μg/ L (BPS1)和100 μg/ L (BPS100) BPS中30天，然后在干净的水中进行90天的净化后对雄性斑马鱼血浆和肝脏中TAG、TC和游离FAs水平的影响。数据用mean ± SD表示（n=4），与溶剂对照组(SC)相比，**p < 0.01。比例尺= 100μm。

5、 BPS对雄性斑马鱼肝脏脂质代谢、UPR、炎症和自噬反应相关基因表达的影响

与对照组相比，1和10 μg/L 的BPS处理组肝脏srebp1(固醇调节元件结合蛋白1)mRNA水平分别显著升高5.6倍和17.6倍（Dunnett测试：F=26.528，p=0.000）。在所有BPS处理组中，肝脏中Acc（acetylcoenzymeA carboxylase）和Fasn（脂肪酸合酶）的mRNA水平显著提高（Dunnett测试：F=43.936，p=0.000和F=24.223，p=0.000），分别提高了3.2-36.6倍和5.2-67.8倍。在1、10、100μg/L 的BPS处理组中，elovl6（elongation oF very long chain Fatty acid 6）的mRNA表达水平分别提高了31.4，29.4，364.7倍（Dunnett测试：F=92.063，p=0.000）。此外，在所有BPS处理组中，脂肪酸分解基因cpt1aa(肉碱棕榈基转移酶1aa)和cpt2(肉碱棕榈基转移酶2)的表达水平也有显著性增加。与对照组相比，在雄性斑马鱼肝脏中，三种剂量的BPS上调了cpt1aa基因5.7-7.1倍，cpt基因25.4-12.6倍（F=32.867，p=0.000；F=20.873，p=0.000）。（图5a）

UPR由三个平行的分支组成，它们在受到压力时被激活，包括通过调节蛋白水解激活转录因子6的 (ATF6)；通过磷酸化真核翻译起始因子2α (eiF2α)调控蛋白激酶RNA (PKR)-like ER kinase (PERK)；inositol requiring enzyme 1 (ire1)的非标准剪接。如图5b所示，在雄性斑马鱼的肝脏中，与对照组相比，hsp5（heat shock protein 5）（F=7.851,P=0.000），perk(F=7.851,P=0.009)，eif2α(F=9.641,P=0.003)和atF4a（激活转录因子4a）（F=9.340,P=0.002）的水平在BPS处理组中有显著的提高；cd154（a ligand of CD40 and a key mediator oF inFlammation）（Dunnett测试：F=25.115，p=0.000）和nf-kb（nuclear Factor-kB）（F=97.403，p=0.005）（F=21.543,P=0.000）在高剂量（100μg/L）处理组有显著提高。ddit3（DNA-damage-inducible transcript3）的mRNA表达水平在BPS剂量为1和10μg/L时显著提高，但在100μg/L时下降。与对照组相比，BPS处理下调了xbp1（X-box binding protein）（F=86.202,p=0.000）的基因表达水平，对ire1（Dunnett测试：F=3.490，p=0.050）和aFt6（Dunnett测试：F=0.297，p=0.827）或map8b（mitogenactivated protein kinase 8 b）（F=2.518,p=0.124）的mRNA表达水平没有显著影响。另外，三种剂量的BPS都上调了两个自噬基因atg3（autophagy related gene 3）（F=15.195，p=0.000）和lc3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）（F=41.506,p=0.000）的表达。炎症反应相关基因il1b（interleukin-1b）（F=4.307,p=0.044）在BPS为1和10μg/L显著增加；tnfα（tumor necrosis Factor alpha）（F=4.361,p=0.043）只在BPS为100时显著增加。ikk（IkappaB kinase 1）（F=3.507，p=0.049）基因表达量在1和100μg/L的BPS处理组显著下调。（图5c）

图5. 120天的BPS处理后对斑马鱼肝脏脂代谢相关基因（srebp1, acc, fasn, elovl6, cpt1aa, cpt2）（a），UPR（hsp5, perk,eif2α atF4a, ddit3, cd154, ire1, xbp1, mapk8b, and atf6）（b）,炎症信号（nf-kb, ikk, il1b, and tnfα）（c）自噬响应（lc3和atg3）（c）基因的表达影响。从受精后3小时到120天，斑马鱼暴露在1 μg/ L (BPS1)和100 μg/ L (BPS100) BPS中。数据用mean ± SD表示（n=4），与溶剂对照组(SC)相比，*0.01< p < 0.05，**p < 0.01。

讨论

本研究首次发现，长期暴露于BPS相关浓度的环境中会导致雄性斑马鱼出现NASH。NAFLD的初始阶段为肝脂肪变性，以肝细胞胞质内TAG以脂滴形式沉积为特征，而单纯的脂肪变性往往是自限性的。尽管幼年斑马鱼暴露于BPS 30天后肝脏内有明显的脂质积累，但成年斑马鱼经过90 d的净化期后肝脏已经恢复。然而，肝脂肪变性可发展为NASH，表现为单纯的脂肪变性、肝细胞损伤(肝细胞球囊化和细胞死亡)和伴有或不伴有纤维化的炎症性浸润。经过120天的BPS处理后，会增加肝脏中脂质积累（包括TAG和TC），提高血浆中AST和ALT的活性，诱导肝细胞凋亡和纤维化，并刺激促炎细胞因子基因的转录。所有这些都反映了长期接触BPS会导致脂肪从单纯的变性向脂肪性肝炎和纤维化转变。

已经证实，肝TAG的积累本身没有毒性，而是通过缓冲脂肪毒性标记前体(如游离FAs)的积累来保护肝脏。因此，FAs代谢紊乱，脂肪合成不平衡，FAs氧化和TAG合成，会导致FAs沉积和脂肪毒性，最终产生脂肪肝表型。转录因子SREBP1调节FAs合成酶ACC和FAS基因的表达。BPS暴露后，特别是在1和10 μg/L时，肝脏srebp1、acc和fasn的mRNA水平大约升高了3.2到67.8倍，说明BPS通过促进FAs从头合成而增加脂肪生成。在最高剂量下(100 μg/L)，虽然BPS暴露对acc和fasn的转录有轻微的刺激作用，但肝脏的elovl6 mRNA水平却显著升高了364.7倍。Elovl6是一种微体酶，调节12、14、16碳饱和和单不饱和FAs的延伸，而elovl6的表达与NASH患者肝损伤的严重程度呈正相关。此外，我们的结果还表明，cpt1aa和cpt2，FAs从细胞质进入线粒体的膜转运体，参与FAs β氧化的初级限速酶的表达，在所有BPS处理组中都显著提高。它反映了在长期接触BPS后，通过增强线粒体β氧化来代偿性清除游离FAs。在我们之前的工作中发现，120天BPS (100 μg/L)暴露可显著增加肝脏agpat和dgat2的转录水平，这两种酶调节TAG的合成，说明对TAG的合成有刺激作用。尽管如此，脂肪生成基因的mRNA表达水平和参与FAs β氧化和TAG合成基因的mRNA表达水平相比，有更高的变化，肝脏中过度合成的FAs不能被有效的平衡。

有害饱和脂肪酸可破坏内质网稳态，诱导肝细胞凋亡。ER是肝细胞中最大的细胞器，是脂质和类固醇合成的主要场所。在作者以前的研究中发现，长期接触BPS会诱导雄性斑马鱼肝脏中的ER结构错乱。ER膜中脂质浓度升高，增加膜的刚性，从而破坏了ER膜的功能，导致ER蛋白折叠能力受损，触发UPR。UPR通过三种跨膜传感器被调节，包括PERK，IRE1α和ATF6。研究表明，内质网应激至少部分是由与内质网应激相关的基因转录水平升高引起的。本研究中，BPS暴露上调了肝脏中的perk和hsp5 mRNA水平，但未影响ire1和atF6的表达。在非应激状态下，PERK被ER结合蛋白绑定在失活状态下，如HSP5。在内质网应激下，HSP5与PERK分离，通过二聚和自磷酸化激活。激活的PERK会触发eIF2α的磷酸化，这是PERK信号转译的起始因子。eIf2α的磷酸化抑制了大部分蛋白质的合成，降低了进入ER的未折叠蛋白的负载，反而增加了调节凋亡基因ddit3的转录因子eIf2α和atf4a的翻译量。已经证明，丙烯酰胺暴露可通过PERK信号级联诱导凋亡神经元细胞死亡。与本研究相似，作者的数据显示，三种剂量的BPS均显著增强eiF2α和atF4a的转录，而1 μg/L和10 μg/L的BPS中ddit3 mRNA水平显著升高。BPS处理组可见凋亡细胞核明显增多，表明1、10 μg/L BPS通过激活perk-atf4a-ddit3通路诱导肝细胞凋亡。此外，100 μg/L BPS处理也可诱导雄性斑马鱼肝脏中出现明显的TUNEL阳性细胞核，但ddit3转录水平下降，提示在高剂量处理下，肝细胞凋亡的机制可能存在差异。在凋亡过程中，细胞分裂成凋亡小体。肝星状细胞的凋亡吞噬促进了成纤维细胞的表型转化，增强了成纤维细胞前成纤维基因的表达和炎症介质的释放，导致肝细胞纤维化和炎症。长期BPS暴露增加了细胞自噬体的积累，增加了两个关键自噬基因(atg3和lc3)和炎症基因(il1b和tnfα)的表达，也促进了雄性斑马鱼肝脏纤维化的发生。本研究中，100 μg/L的BPS显著增加了nf-kb mRNA的转录，降低了ikk的mRNA水平。这表明，经过长期暴露后，perk-nf-kb通路也参与了BPS诱导的肝细胞炎症反应。尽管如此，细胞水平的详细机制还有待进一步研究。

在此基础上，作者的数据表明，120天的BPS暴露会导致雄性斑马鱼肝脏中过量的TAG积累，诱导游离的FAs介导的脂肪毒性，并通过激活UPR增加肝脏对内质网应激反应的脆弱性，触发肝脏纤维化和炎症。它不同于最近的研究，这些研究表明环境污染物，如TCDD和BPA，会导致线粒体功能受损，从而导致NAFLD。虽然作者没有直接证明接触BPS后UPR激活与NAFLD进展之间的因果关系，但大量对鱼类和哺乳动物的研究已经清楚地表明ER应激与脂肪肝疾病之间的直接联系。