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编译：Aimee，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 超重和肥胖与2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病和癌症有关，但不同的脂肪作用并不相同，储存在皮下白色脂肪组织(SWAT)比储存在内脏脂肪更有利于代谢。在这里，我们揭示了mTORC2在控制SWAT脂质处理能力中的关键作用。我们发现，皮下白前脂肪细胞在没有其所必须的mTORC2亚基Rictor的情况下分化，上调成熟脂肪细胞标记物，形成显著的脂质储存缺陷，导致脂肪细胞变小，组织体积缩减，脂质重新分布到内脏和棕色脂肪，并且性别对全身代谢适应性的受到影响。从机制上讲，mTORC2促进由PPARγ和ChREBP控制的特定脂质代谢基因的转录上调，包括控制脂质摄取、合成和降解途径的基因，以及编码主要mTORC2底物和胰岛素效应器的Akt2，进一步探索这一途径可能会发现改善胰岛素敏感性的新策略。 论文ID 实验设计 实验结果 1. mTORC2在体外皮下白色脂肪形成过程中促进脂质填充 为了研究mTORC2在SWAT发育中的作用，我们首先从UBC-CreERT2；RictorloxP/loxP小鼠腹股沟肌库分离出含有前脂肪细胞的基质血管组分（SVF）细胞，并用4-羟基三苯氧胺（4-OHT）对其进行处理以诱导Rictor缺失，从而建立一个初级皮下白脂肪细胞分化模型（图1A）。4-OHT洗脱后，原代Rictor诱导的KO SVF细胞（以下简称Rictor-iKOprimary前脂肪细胞）及其等基因载体治疗对照组按照标准方案进行分化（Zebisch等人，2012）。用油红O（图1B）或LipidTOX和Peripipin 1（PLIN1）免疫荧光（图1C）对分化后的初级脂肪细胞进行染色，表明Rictor-iKOprimary细胞中的脂滴积聚减少；异丙醇提取后油红O染色脂滴的定量显示Rictor-iKOprimary细胞中的中性脂质减少了20%（图S1A）；总细胞数（图S1B）和PLIN1阳性细胞的百分比（图S1C）因Rictor丢失而保持不变，这表明细胞内脂质积聚存在缺陷。我们还诱导野生型SVF细胞（即，没有絮状Rictor等位基因）中的CreERT2活性，以确认未分化细胞中短暂的三苯氧胺暴露或时间重组酶活性都不会影响分化时的油红O染色、Rictor水平或AKT磷酸化（图1A、S1D和S1E），这些数据表明mTORC2调节皮下白脂肪细胞的脂质积聚。 我们观察到Rictor-iKOprimary细胞分化过程中Pparg2、Cebpa、Cebpb、Cebpd mRNA表达无差异(图1D)， Pparg2蛋白表达正常(图1E)；在Rictor-iKOprimary细胞中，尽管mRNA表达谱没有变化，但分化后的PPARg2辅因子C/EBPα表达高于正常蛋白水平(图1D和1E)。缺乏Rictor的原代细胞在细胞分化过程中降低了AKT HM磷酸化(AKT1上的S473, AKT2上的S474)和AKT 和AKT转基序磷酸化(AKT1上的T450, AKT2上的T451)，证实了Rictor消融(图1E和1F)。Rictor-iKOprimary细胞的AKT1-T308/AKT2-T309磷酸化在分化第0天（D0）和第2天（D2）时下降50%，但在第8天（D8）时相对于对照升高(图1F和1G)，这与以往研究中在脂肪细胞中观察到的mTORC2促进但不是AKTT308磷酸化的必要条件一致。有趣的是，对亚型AKT1和AKT2的分析显示，分化过程中AKT2 mRNA的诱导降低，导致第8天时AKT2蛋白的降低(图1F和S1F)。在缺失Rictor的成熟脂肪细胞中未观察到AKT2的转录调控(Tang et al.， 2016)；然而， AKT2水平的降低并不妨碍胰岛素（100 nM）刺激Rictor缺陷细胞中AKT底物的磷酸化（如FoxO1（T24）、GSK3b（S9）或PRAS40（T246）（图1F和1G））。总的来说，这些数据表明，脂肪形成过程而不是分化过程中脂质积累需要mTORC2。 我们还将UBC-CreERT2；RictorloxP/loxPSVF细胞（以下简称Rictor-iKOimortal前脂肪细胞）永生化，以测试永生化是否改变分化动力学和mTORC2依赖性。与原代细胞相似，Rictor-iKOimortal前脂肪细胞具有脂质填充缺陷，与对照组相比，分化后的油红O染色减少了60%（图S1G）。与Rictor-iKOprimary细胞相似，D8 Rictor-iKOimortal细胞显示Rictor和AKT-S473/4磷酸化降低，p-AKT-T308/9稍高，AKT2蛋白减少，C/EBPa蛋白增加（图S1H）。值得注意的是，AKT1 mRNA和蛋白质水平在D8 Rictor-iKOimortal细胞中也增加，这在Rictor-iKO原代细胞中没有检测到，部分是由于AKT1转录增加所致（图S1H和S1I）。永生化细胞中PPARγ2的诱导也有细微差异，如原代细胞中，在D2时正常转录诱导，但此后未能最大限度地扩增（图S1J和S1K）;然而，Rictor-iKOimortal前脂肪细胞表现出许多与Rictor-iKOprimary前脂肪细胞相同的特征，观察到的差异可能是由于永生化过程造成的。 图1 mTORC2促进皮下白脂肪生成过程中的脂质填充 （A）体外实验策略模型。4-OHT，4-羟基三苯氧胺；Cre-neg，Cre阴性细胞；Cre-pos，Cre阳性细胞。（B）分化（第8天）等基因对照和Rictor-iKO原代（Rictor-iKOprimary）细胞的油红O（ORO）染色。（C）分化（第8天）对照组和Rictor-iKOprimary细胞的LipidTOX和Peripin1（PLIN1）免疫荧光染色（比例尺为100 mm）。（D）通过RT-PCR对所示分化日（n=4；均值±SEM）的分化标记基因的相对mRNA表达。（E）分化（第8天）细胞裂解物的免疫印迹。γ1即PPARγ1亚型，γ2即PPARγ2。（F）在分化的第0、2和8天，使用或不使用100 nM胰岛素（ins）刺激的裂解物中指示的总蛋白和磷酸蛋白的免疫印迹。（G）总蛋白和磷酸化蛋白水平的量化。总AKT（星号）反映了AKT1和AKT2水平（n=3；均值±SEM；*p<0.05，**p<0.01）。 2. mTORC2促进脂质处理基因的表达 为了开始探索mTORC2如何调节分化过程中的脂质积累，我们从前体阶段（D0）、终末期分化阶段（D2，当PPARγ2被诱导）和成熟脂肪细胞阶段（D8）的对照和Rictor-iKOprimary SVF细胞中生成了RNA测序（RNAseq）转录体（图1A）。首先在每个分化日对对照细胞和KO细胞进行配对比较，我们发现大多数差异基因表达发生在D2和D8之间（图2A）；例如，我们发现Rictor-iKOprimary细胞中，在D8位点有141个基因显著下调，而在D0和D2位点分别只有52和38个基因；在D0、D2和D8位点分别有37,76和78个基因上调(图2A;表S5)。我们将下调基因归为需要Rictor正常诱导的基因（Rictor-必需基因），上调基因被归为被Rictor抑制的基因（Rictor-抑制基因）（图2A）。基因本体论（GO）术语和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对D0和D2 Rictor-必需基因基因（即下调基因）的路径富集分析揭示了被认为在细胞粘附（n=8）和细胞外基质受体相互作用途径（n=6）中起作用的基因（表S1）。相比之下，D8 Rictor-必需基因在代谢过程中尤其是脂质代谢过程中得到了丰富（n=22）（表S1）。在Rictor-抑制基因中，炎症通路基因发生过度表达（表S1）。值得注意的是，抑制脂肪生成的基因，如Pref1和Pdgfra，不会因Rictor缺失而增加，这与Rictor-iKOprimary细胞在代谢基因表达上有缺陷，但在分化方面没有缺陷有关，因此，mTORC2是脂肪细胞分化过程中脂质代谢基因表达的正调控因子。 我们还比较了D8和D0对照转录组以识别成脂基因，我们将其定义为错误发现率(FDR)上调1.4倍的基因（D8和D0的差异为0.05）。在对照原代细胞中鉴定出825个成脂基因(表S5)。基于此分析，在D8 Rictor-必需基因中，有77个(54.6%)也是成脂基因(表S5)；GO分析发现，脂代谢基因在D8 Rictor-必需基因的成脂基因中高表达(图2B)；KEGG分析进一步确定PPAR信号通路是D8 Rictor-必需基因中得分最高的途径(KEGG结果基于77个基因中的10个)(图2C)。值得注意的是，PPAR信号通路中的Rictor-必需基因编码合成和分解代谢脂质代谢的调节因子（如脂肪酸摄取、脂肪酸氧化、DNL和标签合成(图S2A)）。通过比较D8抗凝剂需要的基因和已发表的PPARγ靶基因数据库，我们确定了几个额外的抗凝剂需要的基因(141个中的41个)可能是PPARγ靶基因(图2D)。此外，根据已发表的数据，Rictor-必需基因中有6个被分别归类为ChREBP靶基因，20个被分别归类为SREBP1靶基因。本节中各类别的完整基因列表见表S5。 对于由RNAseq鉴定出的几种Rictor-必需基因，我们进行了RT-PCR分析，以确认它们在原代细胞中的D8表达差异（图2E）。我们重点研究了调节脂质代谢的基因，包括先前报道的PPARγ靶基因（Scd1、Dgat1、Glut4、Cd36、Lpl、Fabp4、Hsl和Mcad）、DNL基因（Acaca、Fasn和Scd1），以及作为对照的、与Rictor无关的成脂基因（Plin1和ADIPQ）。根据RNA序列数据预测，在D8 Rictor-iKOprimary细胞中编码多种脂质合成代谢途径调节因子的基因（如脂肪酸和TAG合成（Acaca、Fasn、Scd1、Dgat1和Dgat2）以及葡萄糖和脂肪酸摄取（Glut4、Cd36、Lpl和Fabp4）的基因（图2E））。我们还证实了在Rictor-iKOprimary细胞中编码脂解（Hsl）和β氧化（Mcad）等脂质分解代谢过程调节因子的基因衰减（图2E）。通过免疫印迹进一步证实CD36、FABP4、ACC、FASN和SCD1蛋白表达降低（图2F）。相反，PPARγ靶点Plin1和Adipoq不受Rictor丢失的影响（图2E），这也与D8脂肪细胞中正常的Plin1阳性染色相一致（图1C和S1C）。重要的是，对照组CreERT2细胞（图1A）在Acaca、Fasn、Scd1、Cd36、Lpl、Fabp4或Glut4表达中没有缺陷（图S2B）。我们证实，PPARg靶点Cd36和Fabp4的表达降低需要在分化前删除Rictor，因为尽管AKT-S473磷酸化作用被消融，但分化后删除Rictor并没有减弱它们的表达（图S2C和S2D）；相反，DNL基因（Acaca和Fasn）在分化过程中和成熟脂肪细胞中都需要Rictor（图S2D），这与我们之前的体内研究结果一致。因此，没有Rictor，分化的SWAT前脂肪细胞无法建立正常的脂质代谢基因表达程序，包括调节脂质合成、摄取、分解和氧化途径。 为了证实观察到的基因表达差异反映了代谢的变化，我们进行了功能测定。使用14C -葡萄糖，我们发现对照组细胞的脂质合成从D0到D8增加了65倍，并证实D8 Rictor-iKOprimary细胞的从头脂质合成减少了92%，D0细胞也显示出轻微的减少(图S2E)。与Glut4表达降低一致的是，我们还检测到在D0和D8时胰岛素刺激的3H-2-DG葡萄糖摄取分别下降了25%和35%(图S2F)。然而，在细胞外酸化速率的基础上，非胰岛素刺激的糖酵解和海马细胞外通量分析仪测量的糖酵解能力分别较高和正常(图S2G)，这与Rictor-iKOprimary细胞内糖酵解基因表达正常的RNA-seq数据相一致(表S5);图S2A)。使用BODIPY作为检测脂质摄取的探针，我们还检测到在标记10分钟和30分钟后，Rictor-iKOprimary细胞的脂质摄取分别下降了25%和35%(图S2H)，这些数据与mTORC2设定SWAT在脂肪形成期间的一般脂质处理能力的模型一致。 图2 mTORC2在指定的分化日促进脂质处理基因 (A)上调(Rictor抑制)和下调(Rictor必须)基因的表达基因在指定分化日的表达（倍数变化>1.4，调整后p值<0.05）。（B）基因本体论（GO）术语富集分析第8天Rictor必须的脂肪生成基因由数据库进行注释、可视化和综合发现（DAVID）分析。（C） DAVID分析的D8 Rictor必需脂肪生成基因的KEGG途径富集分析。（D）根据已发表的转录激活因子分类的基因。1与ChIP Atlas数据库比较（Oki等人，2018）；2与Iizuka（2017）中列出的ChREBP目标进行比较。*p<0.05。完整的基因名列于表S5和图S2A图例中。 3. 特定的PPARγ靶点需要Rictor进行充分诱导 为了进一步探索mTORC2和PPARγ之间的联系，我们表达了一个PPARγ活性报告基因构建，在对照细胞和Rictor-iKOimmortal细胞的荧光素酶启动子中包含三个PPRE元件，并定量了分化D2时的报告基因活性。与预期的一样，D2细胞与未分化细胞(D0)相比，报告基因活性增加了2倍(图S3A)；当Rictor缺失时，报告基因活性下降53%(图S3A)，而补充PPARγ激动剂罗格列酮可以使对照细胞的报告基因活性提高1.8倍，但对Rictor-iKOimmortal细胞没有影响(图S3A)。同样，在D2对照组细胞中，过表达重组HA-PPARγ2可将报告基因活性提高2倍于基线水平，而在Rictor-iKOimmortal细胞中，这一活性降低了58%，尽管在对照组和KO细胞中重组PPARγ2表达水平相似(图S3A和S3B)。此外，过度表达HA-PPARγ2并不能挽救分化后Rictor-缺乏细胞内的脂滴积累(图S3C)；也不能恢复Cd36、Lpl、Fabp4、Acaca、Fasn或Scd1的表达(图S3D)或ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、ACC或Fasn蛋白的表达(图S3E)，尽管脂质含量和Cd36表达相对于空载体对照表达的Rictor-缺乏细胞有轻微的升高。我们还测试了在完全分化试验中补充罗格列酮是否会改善Rictor-KO表型，罗格列酮确实增加了对照和r在Rictor-iKOimmortal细胞的油红O染色和靶基因表达，但相对于对照，在Rictor-iKOimmortal细胞的脂质积累和基因表达仍显著减弱(图S3F S3H)。总之，这些数据与影响PPARγ活性的Rictor丢失是一致的。 接下来，我们使用染色质免疫沉淀(ChIP)检测原代细胞内源性PPARγ靶基因启动子，以检测PPARγ与PPRE元素的结合以及与PPARγ靶基因活性相关的组蛋白H3K9乙酰化情况。我们检测了依赖于蓖芽孢蛋白(Cd36和Fabp4)和不依赖于蓖芽孢蛋白(Pkm2)的PPARγ靶点的PPRE区域(图S4A和S4B;表S4)；在分化D2时，当Rictor缺失时，PPARγ- PPRE在Cd36、Fabp4和Pkm2启动子上的结合没有变化;然而，在D8时，在没有Rictor的情况下，Cd36和Fabp4 PPREs上的PPARγ结合分别下降了40%和33%(图3A)；相反，与我们的基因表达分析一致的是，PPARγ与Pkm2启动子的结合不受Rictor丢失的影响(图3A)。在D2时，删除Rictor也使Cd36和Fabp4的PPREs中H3K9ac分别降低了40%和44%，在此之前PPARγ结合的可测量损失(图3B)。D8时，两个启动子上的H3K9ac分别进一步降低73%和80%，而在整个分化过程中，Pkm2 PPRE中H3K9ac不受影响(图3B)。用Rictor-iKOimmortal体系也得到了类似的结果;例如，在Rictor-iKOimmortal细胞中，PPARγ与Fabp4-PPRE的结合减少（尽管这种缺陷在永生细胞中比原代细胞早发生2天(图S4C)）；这与永灭细胞一致，但与原代细胞不同，PPARγ的扩增更依赖于Rictor(图S1J和S1K)。此外，总组蛋白H3水平和H3K9乙酰化似乎不受Rictor缺失的影响（图S4D）。这些数据与特异性的PPARγ靶点一致，在分化过程中需要Rictor充分诱导。 图3 特定的PPARγ靶点需要Rictor进行全诱导 （A）在对照组和Rictor-iKOimmortal细胞中Cd36、Fabp4和Pkm2启动子处的染色质免疫沉淀（ChIP）鉴定PPARγ/PPAR反应元件（PPRE）相互作用（PPARγChIP n=3，IgG ChIP n=3；均值±SEM；**p<0.01）：以有IgG的ChIP作为阴性对照。（B）通过ChIP分析，在对照组和Rictor-iKOimmortal细胞中的Cd36、Fabp4和Pkm2启动子处进行H3K9乙酰化（H3K9ac）（PPARg芯片n=3，IgG芯片n=3；数据代表平均扫描电镜；*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）：以有IgG的ChIP作为阴性对照。 4. ChREBPβ和SREBP1n过表达均不足以挽救PPARγ靶基因 在成熟脂肪细胞中，mTORC2正向调控转录因子ChREBPβ及其靶基因在DNL通路中的表达(如Acly、Acc、Fasn)。ChREBPβ也被证明在脂肪形成过程中调节3T3L1细胞中PPARγ的表达和活性；因此，我们想知道在Rictor-iKOimmortal细胞中过表达重组ChREBPα或ChREBPβ是否可以挽救脂质积累和PPARγ基因表达。在对照细胞中，通过油红O染色检测，过表达重组ChREBPβ可使脂质量增加20%(图4A);然而，过表达ChREBPα或ChREBPβ的Rictor-iKO细胞中脂质积累不受影响(图4A)。值得注意的是，表达ChREBPβ可部分恢复ACLY、ACC和FASN的mRNA和蛋白表达(图4B和4C)，但对PPARγ靶基因Cd36、Lpl、Fabp4、Dgat1和Dgat2无影响(图4C)；表达ChREBPα对PPARγ靶基因无影响，对DNL基因表达影响极小(图4A 4C)。SREBP1脂质转录因子与ChREBP共享靶点，其活性与肝脏中的mTORC2呈正相关；然而，有趣的是，我们观察到在Rictor-iKOprimary和Rictor-iKOimmortal细胞中细胞核SREBP1 (SREBP1n)水平升高(图4D和4F)，表明SREBP1处理增加;与此一致，编码SREBP处理抑制剂INSIG1的基因是一个Rictor-必需基因(图2D;表S5)。此外，在Rictor-iKOimmortal细胞中过表达具有转录活性的SREBP1n裂解产物对PPARγ靶基因表达影响不大，也不能恢复脂滴形成(图4E 4G)。因此，ChREBPα/β和SREBP1n过表达都不足以修复细胞在缺乏Rictor的情况下分化时的脂质代谢基因表达缺陷。 与我们在本研究中的发现相反，先前使用棕色前脂肪细胞分化模型的研究表明，PPARγ2诱导需要Rictor，这表明在体外棕色和白色前脂肪细胞分化可能对mTORC2有不同的要求。我们最近发现，在棕色前脂肪细胞模型中，过度表达ACLY或ACLY-S455D部分和完全地挽救了Rictor丢失；然而，在Rictor缺陷的皮下白前脂肪细胞中，稳定过度表达重组ACLY、ACLYS455D或ACLY-S455E不能挽救脂质积聚（图S4E）、pArg2，Cd36或Fabp4基因表达（图S4F），或分化过程中的ACC蛋白水平（图S4G）。事实上，在白前脂肪细胞模型中，过度表达ACLY可增强Rictor缺失对基因表达的抑制作用（图S4F）：这与这些棕色和皮下白色脂肪生成模型有着不同的mTORC2需求是一致的。 图4 过度表达ChREBPβ或SREBP1n不能挽救Rictor丢失 （A）分化控制（EtOH）和Rictor-iKOimmortal（4-OHT）细胞表达空载体（Vec）、ChREBPα或ChREBPβ的油红O（ORO）染色。下面的数字表示异丙醇萃取后油红O的定量（定量）（比例尺，50 mm；均值±SEM）。（B）对应于（A）的裂解产物的免疫印迹。（C）通过RT-PCR对与（A）相对应的基因的相对mRNA表达（n=3；均值±SEM；*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。a-c表示过度表达细胞与载体细胞的比较：a，p<0.05；b，p<0.01；c，p<0.001。（D）分化（D8）对照和Rictor iKOprimary细胞裂解物的Western印迹。fl，全长SREBP1；n，加工过的核SREBP1产品。（E）分化对照和表达空载体（Vec）或SREBP1n的Rictor-iKOimmortal细胞的油红O（ORO）染色。下面的数字代表异丙醇提取后油红O的定量（数量）（均值±SEM）。（F）分化对照组和Rictor-iKOimmortall细胞裂解产物的免疫印迹。S、 E，较短的暴露时间。（G）通过RT-PCR对对照组和Rictor-iKOimmortal细胞中与（E）相对应的基因的相对mRNA表达（n=3；均值±SEM；*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。a-c表示过度表达细胞与载体细胞的比较：a，p<0.05；b，p<0.01；c，p<0.001。 5. AKT1-S473D恢复PPARγ靶基因的表达 接下来，我们研究了挽救AKT HM磷酸化是否可以通过生成表达重组HA-AKT1- S473D或HA-AKT2-S474D磷酸化模拟物的Rictor-iKOimmortal细胞，或其HA-AKT1和HAAKT2野生型和HA-AKT1- S473A磷酸化缺陷对照物来恢复PPARγ靶基因的表达。只有HA-AKT1-S473D在分化的Rictor-iKOimmortal细胞中恢复脂质积累(图5A和5B)。免疫印迹证实了AKT重组蛋白的表达(图5C)：过表达HA-AKT1-S473D也会增加Rictor-iKOimmortal细胞中Chrebpb、Acaca、Pparg2、Fabp4和Cd36的表达以及ACC蛋白的表达(图5C和5D)。HA-S474D-AKT2和部分HA-AKT2野生型也会增加Chrebpb表达，这与最近一项关于棕色脂肪中AKT2和ChREBP依赖性DNL的研究相一致（图5D），并表明AKT1和AKT2可能在ChREBP调节中相互合作或相互补偿；因此，恢复AKT-HM磷酸化足以挽救Rictor依赖性脂质代谢基因的表达。 图5 AKT1-S473D足以修复Rictor-KO细胞的脂质积聚缺陷 (A)表达空载体HA-AKT1、HA-AKT1- s473d、HA-AKT1- S473A、HA-AKT2或HA-AKT2- S474D的分化对照(EtOH)和Rictor-iKOimmortal (4-OHT)细胞的油红O (ORO)染色。(B)从(A)中提取异丙醇后的油红O的定量(标尺，50毫米; 均值±SEM;*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。(C)表达空载体、HA标记的AKT1、AKT1- S473D、AKT1- S473A、AKT2或AKT2- s474d的分化对照(EtOH)和Rictor-iKOimmortal (4-OHT)细胞裂解物的免疫印迹检测。(D) RT-PCR检测(A)对应基因的相对mRNA表达量(n = 3;数据为平均SEM;*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。a-c表示过表达细胞与含载体细胞的比较: a，p<0.05；b，p<0.01；c，p<0.001。 6. SWAT的开发需要体内的mTORC2 为了检验这些发现的生理相关性，我们培育了Prx1-Cre；Rictorfl/fl小鼠（RictorPrx1-Cre），该小鼠Rictor在体内的前体细胞群中被删除，不会产生VWAT或BAT。雌性和雄性RictorPrx1-Cre小鼠在6周龄和12周时体重明显低于对照组（图6A）；各组之间的食物摄入量相等（图S5A）。两种性别中的RictorPrx1-Cre小鼠的SWAT重量明显较轻（雄性轻65%，雌性轻57%）（图6B和6C）。H& E染色和整个SWAT库的成像显示RictorPrx1-Cre小鼠的脂肪细胞面积减小（图6D和6E）；反过来，由于脂肪细胞肥大，雄性RictorPrx1-Cre小鼠的VWAT和BAT质量分别增加60%和35%（图6B-6E）。另一方面，由于细胞肥大程度较轻，雌性RictorPrx1-Cre小鼠（图6B和6C）的VWAT质量只增加了40%（图6D和6E），但雌性小鼠BAT的面积没有显著差异（图6B和6C）。我们通过计算总库细胞数确定组织质量减少主要是由于细胞尺寸较小所致，这揭示了组织重量和平均脂肪细胞体积之间的线性关系（男性SAT的r2=0.97，女性SAT的r2=0.80），表明细胞数量没有显著差异（图S5B）。此外，RictorPrx1-Cr小鼠的SWAT和对照组（图S5C）之间的脂肪细胞前体细胞（APC）数量没有变化，这与SWAT部分脂肪营养不良表型一致，该表型源于脂肪生成过程中的脂质积累缺陷。免疫印迹证实RictorPrx1-Cre小鼠在SWAT后部缺少RICTOR和p-AKT-S473，但在VWAT或BAT中没有影响（图6F）。根据直接标记测量，雄性和雌性RictorPrx1-Cre小鼠均未出现肝脏增大(图S5D)或肝脂肪变性(图S5E)。新生儿分析表明，SWAT脂肪营养不良早在产后D7（P7）就出现，此时SWAT重量减少40%，脂肪细胞更小（图S5F S5H）；这与删除成熟脂肪细胞中的Rictor结果形成鲜明对比（例如，使用脂联素-Cre），后者不会影响标准周龄20周的脂肪组织质量或脂肪细胞大小。这些数据与体内SWAT发育所需Rictor的数据一致，并进一步揭示了Rictor丢失后脂肪组织脂质重新分布的性别差异。 表达Prx1-Cre的前体也会产生一些骨髓脂肪细胞以及成骨细胞和软骨细胞，因此，计算机断层扫描（CT）显示雄性RictorPrx1-Cre小鼠的股骨和胫骨分别缩短了10%和5%，这与较薄的皮质骨和小梁骨有关，后者在雄性中更为突出（图S5I；表S2）。骨骼长度的减少可以解释为什么尽管肌肉具有正常的形态和RICTOR表达，但RictorPrx1-Cre小鼠的股四头肌重量也略有减少（图S5J-S5L）。如锇染色和CT扫描所示，RictorPrx1-Cre雄性小鼠近端区域的骨髓体积（MV）也较少，雌性小鼠骨髓脂肪组织（MAT）呈下降趋势（表S3）。基因表达分析证实雄性和雌性RictorPrx1-Cre小鼠骨髓脂肪细胞中Rictor mRNA表达降低，但Pparg2表达正常（图S5M）。这些数据与先前的研究一致，表明RictorPrx1-Cre也针对骨髓间质和MAT。 7. 雄性RictorPrx1-Cre小鼠出现胰岛素抵抗 接下来，我们探究SWAT功能障碍是否由Rictor缺失引起胰岛素抵抗。有趣的是，8周龄雄性RictorPrx1-Cre小鼠出现胰岛素不耐受，与对照组相比，葡萄糖AUC增加了30%（图S6A），这与雄性小鼠血清胰岛素水平呈上升趋势相关（图S6E），在雌性小鼠中没有观察到这一点（图S6B），而且不同性别的小鼠都没有葡萄糖耐量缺陷（图S6C和S6D），此外，RictorPrx1-Cre雄性小鼠的脂联素、瘦素和非酯化脂肪酸（NEFAs）没有变化（图S6E）；这些结果表明RictorPrx1-Cre雄性小鼠易发生胰岛素抵抗，这与其内脏脂肪的大量积累是一致的。 图6 皮下白色脂肪组织生长需要体内mTORC2 (A)雄性(M)和雌性(F)对照组和RictorPrx1-Cre小鼠的生长曲线(n = 10-14;均值±SEM;t检验；*p<0.05)。(B)皮下白色脂肪组织(SWAT)、内脏白色脂肪组织(VWAT)和棕色脂肪组织(BAT)的组织重量相对体重(n = 8-10; 均值±SEM; *p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。(C) 8周龄雄性对照组和RictorPrx1-Cre小鼠显示的脂肪库的代表性图像。(D)雄性和雌性小鼠(C)中对应组织的H&E染色(标尺，100mm)。(E)各指示库个体脂肪细胞大小分布(n = 4只小鼠;分别从SWAT和VWAT测量了每只小鼠1000个和500个个体脂肪细胞; 均值±SEM;*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001)。(F) 8周大雄性对照小鼠和RictorPrx1-Cre小鼠SWAT、VWAT和BAT裂解物的代表性免疫印迹结果。 8. 在SWAT发育过程中，Rictor是脂质代谢基因表达所必需的 与我们在体外观察到了相似的结果（即在没有Rictor的情况下分化的D8原代细胞中），RictorPrx1-Cre小鼠的SWAT在体内表达PPARg和C/EBPa，以及胰岛素受体β（IRb；高于对照组）（图7A）。同样，与体外模型相似，RictorPrx1-Cre小鼠的SWAT降低了AKT2的mRNA和蛋白质表达（图7A和S7A）。在体内，AKT2表达的减少与p-AKT-T308的减少有关，这与AKT2’s是成熟脂肪细胞中主要的AKT亚型一致。有趣的是，尽管p-AKT-T308减少，p-AS160-T642、p-GSK3b-S9和p-FoxO1-T24保持不变；然而，p-PRAS40-T246有所减少（图7A）。PRAS40磷酸化减轻了其对mTORC1的负面影响，并且p-S6K1-T389（直接mTORC1底物）也被减少（图7A）；当具删除脂联素-Cre的成熟脂肪细胞中的Rictor时，我们在体外（图1F和S7B）或体内没有观察到这种效应，这表明mTORC1-S6K1信号缺陷是分化过程中AKT2诱导减少引起的次要效应。 接下来我们探究是否SWAT脂质处理基因在体内的表达过程中需要Rictor。我们检查所有Rictor所需的合成代谢和分解代谢脂质代谢基因及其产物的情况，并通过原代细胞RNA-seq鉴定(图7A和7B)。然而，脂联素在体内表达减少，但在原代细胞模型中没有(图7B)；这与之前的观察结果相一致，即脂联素水平可能对体内脂肪细胞肌细胞的长期丢失敏感。值得注意的是，从RictorPrx1-Cre小鼠中分离并体外分化的SWAT原代SVF前脂肪细胞也表现出脂质积累减少(图S7C)，脂肪合成和标记合成基因和/或蛋白表达减少(图S7D和S7E)，分化后AKT2表达减少(图S7D和S7E)。此外，脂联素mRNA的表达在分化的初级RictorPrx1-Cre前脂肪细胞中不受影响(图S7E)，这与脂联素mRNA的下调一致，脂联素mRNA的下调是继发于Rictor损失。与以往的数据一致，Rictor缺乏的SWAT也有胰岛素刺激的葡萄糖摄取缺陷和基底脂肪分解增加(图S7F和S7G)。这些数据证实了我们体外研究结果的生理学相关性，以及mTORC2在建立SWAT的脂质处理能力中的作用。 在我们之前对RictorAdipoq-Cre小鼠的研究中发现，成熟脂肪细胞中的Rictor被删除，而不是在本研究中的前体中，当小鼠随意吃标准的食物时，对照组和Rictor缺陷SWAT库中PPARγ靶基因Cd36、Lpl和Fabp4的表达没有变化；我们认为这种差异可以解释为SWAT的发展对mTORC2调节的PPARγ活性有更大的需求，我们想知道缺乏RictorAdipoq-Cre小鼠在SWAT中储存更多的脂质是否会揭示PPARγ基因表达缺陷，为此，我们重新检测了PPARγ基因在RictorAdipoq-Cre小鼠中的表达，这些小鼠在禁食或给予高脂饮食（HFD）后再喂养。结果发现，对RictorAdipoq-Cre小鼠进行长时间禁食后再喂养6小时，导致Cd36、Lpl和Dgat2表达分别减少36%、50%和60%，与对照组相比，组织质量减少33%（图7C和7D）；同样，在HFD上放置RictorAdipoq-Cre 12周未能增加Rictor-KO脂肪中的Cd36、Lpl和Fabp4的表达（图7E），这与脂肪组织脂质增生减少和整体脂肪细胞变小一致（图7F）。我们的结论是，当皮下白脂肪细胞受到生理状态的缺乏时，它们需要最大限度地刺激PPARγ依赖的脂质储存基因的表达，这些生理状态对脂质储存途径有着很高的需求（例如组织发育、快速进食和慢性致肥胖饮食后的再喂养）。 图7 Rictor调节SWAT生长过程中脂质处理基因的表达 （A）8周龄对照组和RictorPrx1-Cre小鼠皮下白色脂肪组织（SWAT）裂解物的免疫印迹。（B）通过RT-PCR对8周龄对照组和RictorPrx1-Cre小鼠的所示基因的相对mRNA表达（n=6-8；均值±SEM;*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。（C）禁食24小时后，8周龄对照组和RictorAdipoq-Cre小鼠的SWAT组织重量（n=8；均值±SEM;***p<0.001）。（D）通过RT-PCR对8周龄对照组和RictorAdipoq-Cre小鼠禁食24小时后6小时的指示基因的相对mRNA表达（n=8；均值±SEM;*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001）。（E）对照组和RictorAdipoq-Cre小鼠在12周HFD或标准chow（SC）喂养后，通过RT-PCR检测所示基因的相对mRNA表达（n=7或8；均值±SEM; *p<0.05，**p<0.01；当HFD样本与SC样本进行比较时，a，p<0.05）。（F）对照组和RictorAdipoq-Cre小鼠在12周的HFD或chow（SC）喂养（标尺，100 mm）后的SWAT的H&E染色。 讨论 在这项研究中，我们探究了mTORC2在SWAT发育中的作用。我们的研究结果支持了一个模型，在这个模型中，皮下白色脂肪细胞的分化需要Rictor/mTORC2来建立最大的脂质处理能力。这部分是通过积极调节特定的PPARγ基因表达介导的，这些基因编码调节脂质储存；一种可能性是，mTORC2调节PPARγ年代能力识别和/或保持与具体目标通过一个相关因素与PPARγ合作(如蛋白质或代谢物),通过下游行动(例如,通过调节染色质状态),或通过直接监管,虽然可能会打破只有选择 PPARγ目标是会依赖于mTORC2的观点；专家认为mTORC2至少部分通过AKT信号通路作用于这些PPARγ基因，此外，成熟皮下白色脂肪细胞中PPARγ靶基因的最大表达需要mTORC2，特别是在促进快速脂质储存和脂肪组织生长的饮食挑战中（如消耗HFD）。TZDs是治疗T2D的药物，通过结合和刺激PPARγ发挥作用，但也有包括潜在的心力衰竭等副作用，。因为mTORC2似乎只能促进一部分PPARγ活性，我们的研究可能有助于确定刺激安全脂质储存和胰岛素敏感性的替代机制。 在现有的白前脂肪细胞分化研究中，棕色前脂肪细胞分化模型中，Rictor是PPARγ mRNA诱导所必需的，因此，当接受标准的体外分化试验时，Rictor缺陷的棕色前脂肪细胞完全不能分化和合成脂滴，这种缺陷与ACLY磷酸化(S455)和乙酰辅酶生成不足有关，这个表型通过过度表达重组体部分挽救和过度表达拟磷酸化结构ACLY-S455D完全挽救。最近一项使用非脂肪细胞模型（原代牛乳腺上皮细胞）的研究也显示，当Rictor被短发夹RNA（shRNA）击倒时，PPARγ2表达受阻。与棕色和白色前脂肪细胞分化模型显示对mTORC2的不同要求（即，此处PPARγ mRNA诱导不需要Rictor），在本研究中，过度表达ACLY-S455D并不能挽救Rictor缺陷皮下白前脂肪细胞的基因表达和脂质积累缺陷。这些棕色和白色脂肪细胞分化模型不同的一个解释是，它们是不同的细胞类型，来源于它们各自部位的天然前体细胞群（即肩胛间蝙蝠和腹股沟肌）；另外，棕色前脂肪细胞通过SV40大T抗原方案永生化，这可能改变PPARγ诱导的代谢要求。确定mTORC2信号如何调节不同细胞类型的新陈代谢和基因表达是一个重要的正在进行的研究领域。 我们还对mTORC2如何调节PPARγ活性进行了探究，我们得到了两种可能的机制：一是PPARγ翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、类泛素化或糖基化）可能对mTORC2信号敏感（例如，PPARγ的磷酸化根据位点和上游调节器增加或减少其活性），或者PPARγ的乙酰化积极调节脂质合成；二是mTORC2调节PPARγ结合某些辅因子的能力，其中可能包括组蛋白乙酰转移酶（HATs）或组蛋白脱乙酰基酶。mTORC2还可以通过影响染色质景观或染色质重塑因子来调节PPARγ结合某些靶点的能力（如本文所示Rictor-KO PPREs中H3K9ac的降低）。将全球基因表达分析与染色质修饰分析相结合，尤其是在体内，对于区分这些可能性非常重要。mTORC2如何调节PPARγ活性的详细机制仍在研究中。 在我们的研究中，另一个有趣的发现是，雄性和雌性小鼠对Prx1 - Cre介导的Rictor缺失的反应不同，这与脂肪再分配和胰岛素敏感性有关（例如，只有雄性RictorPrx1-Cre小鼠产生胰岛素抵抗）。有趣的是，尽管RictorAdipoq-Cre小鼠没有出现脂肪营养不良，但它们也存在胰岛素抵抗，而且这在雄性小鼠中更为明显。因此，男性脂肪mTORC2在控制全身胰岛素敏感性方面可能比女性发挥更大的作用，而SWAT可能对这一现象尤为重要，控制这一现象的机制目前尚不清楚。然而，这些观察结果增加了对脂肪组织代谢调节的性别差异的认识（例如，最近有报道称，无脂联素的小鼠比雄性KO小鼠有更严重的代谢表型）。理解脂肪组织代谢的性别差异是一个正在进行的研究领域。 我们研究的一个局限性是，除了SWAT, Prx1-Cre还可以靶向其他细胞系，包括一些骨系和骨髓脂肪细胞，然而，对于本研究而言，Prx1-Cre并不针对棕色脂肪或内脏白色脂肪的前体。本实验所建立的模型在体内具有不同的分化功能，包括在体外培养的三种不同的小鼠模型中显示出不同的分化能力，然而，在体内模型中不能排除非脂肪组织细胞中Rictor丢失引起的改变，也无法确定Cre对VWAT的具体影响，因此，我们无法确定mTORC2在VWAT发育中的作用。（翻译腔）虽然我们的AKT拯救实验支持了Rictor通过mTORC2促进脂质基因表达的模型，但我们不能确定Rictor在脂肪组织中也可能具有不依赖于mTORC2的功能。Rictor生物学的这一方面仍然知之甚少。 总的来说，我们的研究揭示了先前未知的mTORC2在调控SWAT生长、脂肪组织基因表达和性别依赖性代谢稳态中的作用。这些结论可能对理解和治疗T2D和其他肥胖相关的代谢性疾病具有重要意义。 https://www./science/article/pii/S2211124720312122 |
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