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综述 | 北京大学:通过蛋白质组学发现免疫代谢中的翻译后修饰(国人佳作)

 微科享 2021-04-19

编译:子橘,编辑:Tracy、江舜尧。

原创微文,欢迎转发转载。

导读

先天免疫在抵抗病原体入侵的宿主防御中起着关键作用,其中巨噬细胞是必不可少的组成部分。在免疫激活过程中,巨噬细胞也会经历代谢重整,并且其主要的能量来源于TCA循环转变为有氧糖酵解这一过程。细胞也可以产生一系列源自TCA周期或糖酵解的内源性代谢产物,它们可以充当免疫信号分子。许多“免疫代谢物”和/或其酰基辅酶A衍生物具有内在反应性,比如琥珀酸酯,衣康酸酯,富马酸酯,乳酸酯和甲基乙二醛(MGO),它们能够通过翻译后修饰共价修饰特定酶以改变其功能。这些代谢物的发现和修饰目标的识别对于理解其免疫调节作用将非常重要。本文是一篇综述,旨在全面了解蛋白质组中免疫代谢物修饰的情况。


论文ID


原名:Discovery of post-translational modifications inimmunometabolism by chemical proteomics
译名:通过蛋白质组学发现免疫代谢中的翻译后修饰
期刊:Current Opinion in Biotechnology
IF:8.288
发表时间:2020.10
通讯作者:王初
通讯作者单位:北京大学合成与功能生物分子中心

内容


1. 免疫亲和捕获

在这种类型的方法中,研究人员开发了特异性抗体来识别和富集具有PTM的蛋白质或肽,随后通过质谱对其进行蛋白质组学分析(图1a)。由于抗原-抗体相互作用的非共价性质,这些基于免疫亲和力的方法主要建立在所用抗体的效力和特异性之上。赖氨酸酰化是由酰基辅酶A中间体介导的蛋白质上翻译后修饰(PTM)的重要组成部分(图1b)。这些CoA分子是细胞中高度活化的代谢产物,可以在巨噬细胞活化过程中检测到其积累,最近的研究表明,它们可以在调节炎症信号和细胞因子产生中发挥重要作用。

丙二酰辅酶A可以通过乙酰辅酶A羧化酶(ACC)从乙酰辅酶A转化而来,通常参与脂肪酸和类固醇的合成。此外,它还可以引起蛋白质赖氨酸的丙二酰化(图1c) 2015年,Du等人用基于免疫亲和力的蛋白质组学方法在2型糖尿病小鼠的肝脏组织中鉴定出总共573个丙二酰化赖氨酸位点。许多丙二酰化蛋白都参与糖酵解和脂质代谢,比如3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和ATP-柠檬酸裂合酶(ACLY)。在另一项功能研究中,Galván-Peña等人发现在活化的巨噬细胞中,丙二酰辅酶A的积累可能导致GAPDH K213的丙二酰化,从而致使TNF-α翻译,并使相关炎症加重。

在活化的巨噬细胞中,琥珀酸酯代谢紊乱会导致另一种TCA中间体琥珀酰-CoA的积累,从而导致蛋白质的琥珀酰化。这种修饰将使赖氨酸上的末端电荷从+1变为-1,并诱导靶蛋白的构象变化。据报道,关键糖酵解酶丙酮酸激酶激酶M2(PKM2)的琥珀酰化作用会极大地影响巨噬细胞的IL-1β诱导。在基于SILAC的蛋白质组学方法上,Park等人结合免疫亲和力进行了哺乳动物琥珀酰化酶的系统分析,并定量了小鼠细胞中779种蛋白的2565个琥珀酰赖氨酸位点,这些蛋白跨越了多种代谢途径。在病原体方面,Yang等通过免疫亲和蛋白质组学在结核分枝杆菌中鉴定了超过1500个琥珀酰化位点,其中,大量的修饰蛋白参与了代谢途径。

长期以来,乳酸一直被认为是糖酵解过程中产生的代谢废物,但是,最近有证据表明,乳酸也是一种免疫代谢物。除了与癌症的联系,乳酸盐还可以通过免疫抑制机制抑制CD8 + T细胞迁移,并通过在RLR途径中靶向MAVS来抑制先天免疫。在2019年,芝加哥大学的赵应明教授及其团队报告了一种由L-乳酸盐组成的新型组氨酸赖氨酸的PTM,称为“乳糖基化”,并将这种常见的代谢物与基因表达的表观遗传调控联系起来。他们首先通过使用合成肽标准品的LC-MS/MS证实了赖氨酸(Kla)的修饰;然后,他们提出了一种特殊的“酰化”抗体,用于基于免疫亲和力的蛋白质组学分析,并在人MCF-7细胞和小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的组蛋白中鉴定出多个组蛋白Kla位点。研究表明,乳酸急剧产生导致在细菌攻击下,巨噬细胞中的组蛋白乳酸化,进而激活了表观遗传机制,以帮助修复感染过程中宿主引起的附带损害。这项研究不仅为深入探讨乳酸的免疫调节和其他生物学作用开辟了一个新视角,而且为通过基于蛋白质组学的方法发现新型功能性PTM提供了令人信服的例子。

图1 通过免疫亲和捕获方法分析免疫代谢中赖氨酸酰化位点

(a)该方法的一般工作流程。(b)通过活化的酰基辅酶A形成赖氨酸酰化。(c)由免疫代谢物诱导的赖氨酸酰化的结构。

2.竞争分析

某些免疫代谢物具有内在反应性,可以直接修饰蛋白质中的亲核残基,而无需通过CoA中间体。研究者利用位点特异性和定量化学蛋白质组学平台(例如isoTOP-ABPP),可以实施竞争性分析策略来全面分析蛋白质组中免疫代谢物的修饰。在这种策略中,通用探针会被用于标记亲核残基,例如半胱氨酸,如果代谢产物共价修饰相同的残基位点,则它们会竞争激烈。探针标记上的竞争可以通过Cu(I)催化的叠氮化物炔烃环加成反应(CuAAC)介导偶联的同位素标记的生物素亲和标签以及LC/MS-MS定量探针修饰的多肽而被读出。据报道,兼容的探针可标记半胱氨酸,赖氨酸,酪氨酸和蛋氨酸。该方法不仅适用于检测内源性代谢物的修饰,而且适用于发现共价配体或药物的靶标。

富马酸酯是TCA周期的中间代谢产物。它是在琥珀酸脱氢酶(SDH)的催化下由琥珀酸产生的,随后被富马酸水合酶(FH)转化为苹果酸。它不仅是一种合成代谢物,而且与先天免疫训练中的炎症信号传导有关。从化学层面上看,富马酸酯是一个弱的迈克尔受体,具有被两个羧酸夹在中间的双键(图2c),并且可以与蛋白质中的半胱氨酸直接反应,产生所谓的“S-琥珀酸化”。 富马酸盐在LPS激活的巨噬细胞中积累,且发现关键的蛋白质靶标包括KEAP1,线粒体乌头酸酶(ACO2),GAPDH和GSDMD。Meier等人用半胱氨酸反应性碘乙酰胺-炔(IA-炔)探针实施竞争性isoTOP-ABPP策略(图2b),系统分析了对FH突变HLRCC细胞系中富马酸酯修饰敏感的半胱氨酸位点。他们鉴定了684个高信度FH调节的半胱氨酸,其中检测到28个已知的S-琥珀酸靶标,该研究为将来研究富马酸酯的致瘤作用和免疫调节作用提供了丰富的资源。类似的方法也已被用于全局分析人类和小鼠T淋巴细胞中富马酸二甲酯(DMF)的共价靶标,DMF是富马酸酯的亲电子类似物,并且是FDA批准的用于治疗自身免疫的药物疾病。

衣康酸酯是巨噬细胞活化过程中的另一种重要的免疫代谢物,具有强大的抗炎和抗菌活性。LPS刺激后,再由线粒体相关的免疫应答基因1(IRG1)催化,顺式-衣康酸酯可产生浓度超过1 mM的衣康酸酯。与富马酸酯相似,衣康酸酯也具有α,β-不饱和羧酸的亲电子结构,可通过迈克尔加成反应与半胱氨酸共价反应,产生“衣康构”(图2c)。相关生化研究已经确定了与衣康酸酯的抗炎功能有关的单个靶标,比如Keap1,GSH和NLRP3。但是,由于缺乏相应的抗体,衣康酸酯的整体研究进展受到了阻碍。在2019年,我们小组报告了基于S-糖基化竞争半胱氨酸分析策略的第一个全球衣康体位点分析。我们最初使用IA-炔烃探针进行分析,但未观察到衣康酸酯的强烈竞争,这很可能是由于其亲电性很弱。受偶然发现的“脱靶”S-糖基化作用的启发,我们开发了一种非天然单糖探针1-OH-Az,该探针具有与衣康酸酯相似的轻度硫醇反应性,因此可以有效竞争。我们结合了定量质谱,在巨噬细胞的蛋白质组中总共鉴定了260个高可信度的衣康酸酯修饰位点,并揭示了一种新型的反馈环机制,其中衣康酸酯修饰和抑制了关键的糖酵解酶ALDOA和LDHA以抑制炎症。

图2 使用竞争性分析通过免疫代谢物分析共价半胱氨酸修饰

(a)竞争性isoTOP-ABPP的一般工作流程。(b)半胱氨酸反应探针的结构。(c)具有迈克尔受体的衣康酸,富马酸酯和富马酸二甲酯(DMF)的亲电子免疫代谢物的结构。

3. 生物正交标记

生物正交标记方法需要化学合成探针,这些探针在结构上类似于目标代谢产物,并具有通过生物正交反应富集的其他功能基团。目前用于探针设计最流行的生物正交基团是炔烃和叠氮化物,它们可以之后与应变促进或铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(SPAAC或CuAAC)结合。这个过程中,首先需要先确定探针的生物学活性与天然代谢产物相似,然后再将其用于标记蛋白质组(体外)或活细胞(原位)。遵循TOP-ABPP规程,研究者可以通过LC-MS/MS进一步鉴定探针标记的蛋白质和残基位点(图3a)。

已开发出炔烃官能化的探针可以分别用于表征蛋白质的丙二酰化作用和S-琥珀酰化作用(图3b)。关于Itaconation,研究者最近开发了一种特定的生物正交探针,可直接在活的巨噬细胞中进行定量和位点特异性分析。可渗透细胞的探针“ITalk”包含被酯化为衣康酸酯核心结构的生物正交炔烃,并具有与衣康酸酯相当的抗炎作用(图3b)。结合定量蛋白质组学管线,我们已经确定了衣康酸的近2000个蛋白质靶标和炎性巨噬细胞中的1000多个修饰位点。我们的数据揭示了参与炎症反应和宿主防御的多种蛋白质中的多个衣康体位点,并且还通过RIPK3信号在衣康体与坏死病之间建立了新的联系。

微生物群可以产生短链脂肪酸(SCFA),以调节宿主的新陈代谢,免疫力和感染易感性。丁酸盐是一种来源于卫生的典型代谢产物,已被证明具有抗炎和抗微生物的功能。为了探索丁酸酯抑制病原体毒力的机制,Hang等人开发了一种基于丁酸盐的化学探针alk-3(图3b),并将其与无标记的定量蛋白质组学一起用于鉴定肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌中丁酸盐的酰化蛋白质靶标。他们发现SCFA探针将几种毒力因子酰化,而进一步的功能研究证实,这些修饰使微生物群衍生的代谢产物能够直接抑制体内的微生物发病机理。同一小组还开发了类似的化学蛋白质组学策略,可用于分析其他类型的蛋白质酰化反应,其中许多功能与细菌的毒力和致病性有关,例如蛋白质N-肉豆蔻酰化,S-棕榈酰化和Nε-Lys-脂肪酰化。

甲基乙二醛(MGO)是一种有毒的糖酵解副产物,与炎症和氧化应激水平升高的疾病密切相关。除了能在调节转录和染色质结构中发挥作用,最近有研究表明,它能够通过抑制GAPDH来调节Notch信号并介导CD8+ T细胞的免疫抑制,MGO的二羰基结构对蛋白质中的赖氨酸和精氨酸具有高反应性,形成高级糖基化终产物(AGEs)。在2013年,Johannsen等人开发了炔烃功能化的MGO探针AlkMG(图3b),并在细胞裂解物中进行了荧光标记。后来,他们将探针与TOP-ABPP管线一起应用,以识别血浆蛋白质组以及红细胞蛋白中的100多个MGO修饰的蛋白和300个修饰位点。其中,AlkMG探针也被用于基于SILAC的ABPP分析实验中,以鉴定350个具有赖氨酸“ lacotyolation”修饰的蛋白质。“乳酸化”在结构上类似于在组蛋白上发现的赖氨酸“乳酸化”;然而,据信它是通过MGO与GSH反应形成的乳糖酰谷胱甘肽中的d-乳酸部分的非酶酰基转移而介导的。最后,最近也有研究发现了MGO的新作用,它可以使Keap1交联并促进其二聚化,从而在糖酵解和Keap1-Nrf2转录轴之间建立了直接的联系。

图3 用生物正交标记对免疫代谢物进行的修饰分析

(a)TOP-ABPP的一般工作流程。(b)不同免疫代谢物的生物正交探针的结构。

结论

化学蛋白质组学已成为全局性发现由反应性代谢物诱导的功能性PTM的强大工具,这使我们有机会更好地了解PTM在免疫代谢中的作用。上述化学蛋白质组学研究已经揭示了免疫代谢物的数千个修饰位点,但是,考虑到蛋白质组中蛋白质的数目多,代谢物结构的多样性以及相互作用网络的复杂性,它们可能仅是“冰山一角”。未来,科学和技术挑战仍然有待解决。

原文链接:  
https://pubmed.ncbi.nlm./33113497/

   



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