【原】科研 | Cell Rep.：肥胖患者中血脂和肝脏脂肪含量影响血浆和粪便胆汁酸与遗传和微生物间的相关性

微科享 2021-04-19

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编译：孙元芳，编辑：Emma、江舜尧。

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导读

胆汁酸(BAs)涉及肥胖相关疾病的病因学，如非酒精性脂肪肝。不同结构的胆汁酸通过法尼酯X受体（FXR）或者G蛋白偶联胆汁酸受体1（TGR5）显示不同的信号转导活性。本研究分析297个肥胖患者的血浆和粪便中的胆汁酸含量以及血浆中7a-羟基-4-胆甾烯-3-酮（C4）含量，确定潜在的遗传和微生物决定因素，并建立胆汁酸与肝脏脂肪含量和血浆脂质参数之间的关联。我们确定了50种胆汁酸与27个基因和439个微生物的相关性。另外，我们报道了胆汁酸与88个脂质参数之间的111条相关性，主要反映C4参与的肝脏胆汁酸合成。血浆胆汁酸谱的个体间差异并不反映肝脏胆汁酸合成途径，而是反映肠肝循环中的转运和代谢。我们的研究揭示了肥胖中胆汁酸的遗传和微生物决定因素，以及它们与疾病相关的脂质参数的关系，这些参数对于设计针对胆汁酸信号通路的个性化疗法非常重要。

论文ID

原名：Genetic and Microbial Associations to Plasma and Fecal Bile Acids in Obesity Relate to Plasma Lipids and Liver Fat Content

译名：肥胖患者中血脂和肝脏脂肪含量影响血浆和粪便胆汁酸与遗传和微生物间的相关性

期刊：Cell Reports

IF：8.109

发表时间：2020.10

通讯作者：FuJingyuan & Kuipers Folkert

通讯作者单位：格罗宁根大学

实验设计

实验结果

1. 血浆胆汁酸谱的轮廓显示出较大的变异性，但与粪便比较一致

我们分别评估了300-肥胖患者队列中297名参与者和276名参与者的空腹血浆和粪便样本中个体胆汁酸的浓度。我们还定量了血浆C4含量和粪便中胆固醇、二氢胆固醇和粪甾醇含量。在本研究中，我们选择在大于10%的个体中出现的54种胆汁酸进行分析。血浆和粪便中胆汁酸的浓度和组成在该队列中显示出显著的个体间差异（图1A和1B）。血浆中总胆汁酸浓度的范围为0.08至13.56 mM(图1A)，与在健康受试者中观察到的变化类似，而粪便中胆汁酸浓度的范围为0.72至69.08 mmol/g(干重)。共有14个胆汁酸显示出男性和女性之间的显著差异（错误发现率[FDR]<0.05）（例如血浆中牛磺酸与甘氨酸结合的胆汁酸的比率），但未发现与年龄的显著相关性，可能与该队列相对较小的年龄范围（54至81岁）有关。

人类肝脏胆汁酸合成可产生CDCA或CA。值得注意的是，我们发现一些受试者在血浆中显示出CDCA及其代谢产物的优势，而在其他受试者中，大部分血浆胆汁酸来源于CA途径（图1B）。血浆CA/CDCA值在0.13到6.82（平均值为1.45），CA/CDCA等于12α-OH胆汁酸/12α-non-OH胆汁酸等于（CA+CDCA）/(CDCA+LCA+UDCA)。令人惊讶的是，受试者特异性血浆CA/CDCA比率与粪便中测定的CA/CDCA比率相关性较小（图1C）。粪便CA/CDCA比值(反映肝脏产生两种初级胆汁酸的比率)平均值为0.96(范围为0.15-3.22)。但是令人惊讶的是，在队列中，粪便CA/CDCA比率与血浆中观察到的胆汁酸的不同梯度并不相似（图1B）。

血浆和粪便中胆汁酸的相关性分析显示了几个不同的簇（图1C）.血浆C4浓度为3.92到835.12μM，与粪便总胆汁酸含量呈正相关（图1D）,与粪便CA/CDCA值呈较弱的正相关性。这提示我们在胆汁酸总合成较高的受试者中，CA通路的贡献更大。一般来说，粪便中的二级胆汁酸与血浆中的二级胆汁酸呈正相关，而与血浆中的一级胆汁酸呈负相关（图1C）。因此，血浆和粪便中次级和初级胆汁酸的比率是相关的（图1E），说明并不是所有的初级胆汁酸都被人类结肠中的细菌代谢。粪便中性甾醇(即胆固醇及其主要细菌代谢物粪甾醇)与粪便中的总胆汁酸和个体呈正相关。综上所述，肠肝循环不同分支中胆汁酸谱的巨大个体间差异表明，如果我们想基于胆汁酸信号通路设计有效的个性化治疗肥胖症相关疾病，建立人类血浆胆汁酸谱决定因素的重要性。

图1 在300患者队列中，空腹血浆和大便钡实体的资料显示出较大的个体间变异性和适度的一致性

（A）个体受试者的空腹血浆（n = 297）和粪便（n = 276）胆汁酸的浓度。（B）个体受试者中空腹血浆（n = 297）和粪便（n = 276）胆汁酸的比例。每个条形图代表一个人，上面板和下面板的顺序相同。颜色代表不同的胆汁酸。白色条表示缺少的粪便样本。分别在21％和1.5％的受试者的粪便中少量检测到UDCA和猪去氧胆酸，并且这两个胆汁酸均未包括在图中。（C）血浆和粪便BA实体之间的Spearman相关性（n = 276）。 FDR <0.05时，星代表显着相关性。点表示p <0.05时具有显着的相关性。（D）血浆C4和粪便中总胆汁酸之间的Spearman相关性（n = 276）。（E）血浆（n = 297）和粪便（n = 276）中次要/主要胆汁酸比值之间的Spearman相关性。

2. 胆汁酸的遗传决定因素

通过对54个胆汁酸进行数量性状基因座（QTL）定位，在控制混杂因素（年龄、性别、BMI、疾病、药物和微生物组）后，我们为23个胆汁酸实体（14个血浆，9个粪便）鉴定出27个独立的遗传-胆汁酸关联（p<5×10^-8）（图2A）。值得注意的是转运蛋白基因溶质载体家族35成员C1 (SLC35C1)的一个内含子变体(rs2121703)，该基因编码一个调控Wnt信号转导的二磷酸胞苷聚焦转运蛋白，与DCA的血浆浓度有关（图2B）。另一种基因间变异体(rs1968543)是转运体基因溶质载体家族39成员A8 (SLC39A8，基因间变异体)，参与锌和锰的转运，与TDCA血浆浓度相关（图2C）。此外，还发现四种与锌指蛋白相关的遗传变异(ZFN569、ZFN250、ZFN706和JAZF1)与五种胆汁酸相关，特别是粪便胆汁酸和胆固醇含量（图2A）。例如，JAZF1相关内含子变异rs10255700被发现与粪便胆固醇水平有关。此外，我们观察到编码内向整流钾通道Kir2.1（KCNJ2）的基因间变异（rs55638783），与血浆TDCA的浓度和比例有关（图2A）。观察到的胆汁酸的遗传决定因素强调了在开发针对肥胖的个性化胆汁酸疗法时考虑遗传背景差异的重要性。

图2 胆汁酸的遗传决定因素

（A）曼哈顿图显示了在全基因组范围内的显着水平（p <5×10-8）的27个独立（LD r2 <0.05，500 kb）遗传-胆汁酸关联。（B）SLC35C1内含子变体rs2121703与血浆DCA相关（n = 297）。（C）SLC39A8基因间变体rs1968543与血浆TDCA（n = 297）相关。

3. 胆汁酸的微生物决定因素

接下来，我们开始识别与胆汁酸相关的微生物因素，并发现在FDR < 0.05时，45个胆汁酸共有439条胆汁酸-微生物相关性（图3A）。其中44个胆汁酸与61个细菌种相关（共201个相关性），30个胆汁酸与112个细菌途径相关。对16个胆汁酸进行了遗传关联和微生物相关性检测。因此，我们研究了胆汁酸基因座与肠道微生物组之间的关联，并观察到遗传学和微生物组可能在塑造胆汁酸谱中起附加作用。

我们发现了几个微生物物种聚集在一起，并显示与次级胆汁酸的强正相关和与初级胆汁酸的负相关。其中包括能够介导初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的著名微生物物种（例如Eubacterium hallii、Ruminococcus torques、Doreaformicigenerans）。此外，许多微生物与胆汁酸的相关性在这项分析中变得明显。例如，最近发现的与肝脏脂肪含量相关的Ruminoccussp_5_1_39BFAA与GDCA的比例和血浆中的次级/初级胆汁酸比率呈正相关(图3A)。我们进一步注释了该物种的基因组，并确定了氨基酸序列的三维结构，该序列由一个基因（g000664，63705到64702bp）编码，该基因与胆酰甘氨酸水解酶具有高度同源性（全球模型质量估计，GMQE=0.79）(图3B)，负责解偶联的微生物酶。此外，我们发现丰富的抗NAFLD物种普氏嗜藻杆菌与多个胆汁酸呈负相关，特别是与iso-LCA的粪便水平呈负相关（图3A和3C）。有趣的是，该物种中参与膜形成的CDP-二酰甘油生物合成途径与粪便中iso-LCA浓度呈负相关（图3D），这表明iso-LCA可能通过调节膜形成来干扰F. prausnitzii的丰度。这些结果表明，改变肠道微生物组可能是调节胆汁酸代谢以治疗肥胖相关疾病的策略。

图3 胆汁酸的微生物决定因素

（A）在FDR<0.05时，61个微生物种与44个胆汁酸的201条相关性。（B）Ruminococcussp_5_1_39BFAA基因组包含一个潜在的胆汁酸解结合基因（g00664，从63705到64702bp）。（C）Faecalibacteriumprausnitzii的丰度与该物种的膜形成途径（CDP二酰甘油生物合成途径）的丰度高度相关（Spearman相关，n=297）。（D）F. prausnitzii CDP-二酰基甘油的生物合成途径与粪便中的iso-LCA浓度呈负相关（Spearman相关，n = 276）。

4.与肥胖相关疾病和药物相关的胆汁酸

由于有报道认为胆汁酸与肥胖相关疾病的病因有关，我们在调整了年龄和性别之后，检查了胆汁酸是否与肝脏脂肪含量有关；是否存在与肥胖相关的疾病，如糖尿病、高血压和血脂异常；或是否使用了相应的药物（抗糖尿病、抗高血压、抗高血压、抗高血压、抗高血压等以及降脂药物）。总的来说，在FDR<0.05时，我们观察到18个胆汁酸与疾病的相关性和15个指标的相关性（图4A）。其中大多数来源于细菌性胆汁酸（总次级胆汁酸、DCA、GDCA和TDCA）之间的关系，包括总次级胆汁酸与肝脏脂肪含量之间的相关性（图4B），以及使用抗糖尿病药物的受试者次级与初级胆汁酸比率较高（图4C）。出乎意料的是，我们发现与其他胆汁酸相比，血浆CA和粪便LCA的比例显示出与疾病和药物相反的关系（图4A）。此外，我们还检查了血浆和粪便12α-OH/12α-non-OH 胆汁酸比值与糖尿病和肝脏脂肪含量的关系。我们可以证实以前的发现，血浆和粪便中12α-OH/12α-non-OH胆汁酸比值与糖尿病的发生呈正相关，而与肝脏脂肪含量的相关性无统计学意义（p>0.05）。

5.疾病相关血浆代谢物与胆汁酸的联系

胆汁酸和胆汁酸信号通路已被证实参与了血脂和脂蛋白水平的控制。因此，在调整了年龄和性别后，我们检查了核磁共振（NMR）平台测定的54种胆汁酸和225种代谢物之间的相关性，包括总血脂浓度和14种脂蛋白亚类的相对组成、脂蛋白颗粒大小、载脂蛋白，氨基酸和胆固醇。在FDR<0.05时，我们观察到111个胆汁酸与88个血浆代谢物的相关性。有趣的是，胆汁酸和血浆代谢物之间的相关性形成了四个不同的簇（图4A）。大多数强相关性与含极低密度脂蛋白（VLDLs）的甘油三酯有关，其中48个与血浆C4水平呈正相关（图4A），表明肝脏胆汁酸合成在肥胖受试者血浆甘油三酯水平的调节中起重要作用。图4D显示了血浆C4和总甘油三酯浓度之间的关系。此外，我们观察到血浆C4与血浆胆固醇含量参数（例如，低密度脂蛋白颗粒的中值直径、大LDL颗粒中游离胆固醇与总脂比率、低密度脂蛋白颗粒的平均直径；图4E）之间存在负相关关系。在FDR<0.05时，我们没有观察到12α-OH/12α-non-OH胆汁酸比值与血脂参数之间的任何显著相关性。然而，综合来看，这些结果表明BA与肥胖患者的脂质代谢有着密切的联系。

图4 胆汁酸与疾病、药物和血浆代谢物有关

（A）在FDR<0.05时，18种疾病-胆汁酸、15种药物-胆汁酸和111种代谢物-胆汁酸的相关性被确定。（B）血浆总继发性碱性磷酸酶与肝脏脂肪含量相关（Spearman相关，n=267）。（C）抗糖尿病药物使用者（红色）和非使用者（蓝色）血浆次级/初级BAs比值差异（Wilcoxon试验，n=297）。（D）血浆C4浓度与血浆总甘油三酯浓度相关（Spearman相关，n=297）。（E）血浆C4浓度与低密度脂蛋白颗粒平均直径相关（Spearman相关，n=297）。

讨论

在这项对297名个体胆汁酸代谢的综合多组学分析中，我们发现在300个患者队列中，空腹血浆和大便样本中胆汁酸的分布表现出显著的个体间差异，其中包括54岁或以上的超重个体，一个有高代谢综合征风险的目标人群，将来可能受益于基于胆汁酸的治疗。血浆胆汁酸浓度和C4水平的变化已被报道为健康受试者体内胆汁酸代谢的一个特征，但其潜在原因仍不清楚。令我们惊讶的是，我们在血浆中观察到的来自CA和CDCA途径的肥胖人群的个体内差异并没有反映在粪便中。然而，我们发现血浆C4水平，一个确定的肝脏BA合成指标，与粪便胆汁酸浓度呈正相关。因此，在整个队列中，CA与CDCA衍生的胆汁酸在粪便中的变量贡献（范围从0.15到3.22）可以解释为反映两种合成途径对个体参与者循环胆汁酸池的贡献。值得注意的是，在我们的研究中发现的平均CA/CDCA比值为0.96，相当于由稳定同位素稀释技术确定的肥胖受试者（1.13）、标准化饮食的瘦身受试者（1.50）和正常饮食的健康受试者（1.14）的平均比值。然而，在粪便中发现的CA/CDCA比率与个体参与者血浆中的CA/CDCA比率之间只有非常微弱的关系（图1B）。因此，受试者之间血浆胆汁酸成分的巨大差异很大程度上是由于胆汁酸肝肠循环过程中代谢和/或转运过程的个体间差异造成的。到目前为止，所涉及的潜在过程的性质和贡献还没有被探索，而且由于人类胆汁酸代谢的复杂性，它们的识别需要一种像本研究中应用的基于系统的方法。

我们的数据显示，在肥胖的人类中，遗传和肠道微生物群都与血浆和大便胆汁酸有关，并可能在合成胆汁酸中起到附加作用。在目前的研究中发现，与胆汁酸的遗传关联揭示了肥胖中人类代谢的潜在基因决定因素。此外，我们还发现了四种锌指蛋白相关的遗传变异（ZFN569、ZFN250、ZFN706和JAZF1）与五种粪便胆汁酸相关，包括粪便DCA和CDCA含量。我们发现JAZF1相关内含子变异rs10255700与粪便胆固醇水平有关。我们还观察到编码内向整流钾通道Kir2.1（KCNJ2）的基因间变异，KCNJ2是一种与室性心律失常相关的脂质门控离子通道，与血浆TDCA浓度和比例有关。

我们还检查了定位于（250 kb）内或附近的遗传变异63个，证实了胆汁酸代谢相关基因处于较低水平（p<1×10-5），并证实了胆汁酸与相关转录因子（如LXRa、RXRa、VDR）和参与胆汁酸合成的酶（CYP7B1）的关联，与肝脏和肠道转运体（ABCC1和SLC10A2/ASBT）有关。有趣的是，与回肠BA转运体ASBT相关的rs9586012基因间变异与初级胆汁酸的粪便含量有关，这表明初级胆汁酸流入结肠的增加和/或微生物胆汁酸解偶联/脱羟基活性降低。我们发现的微生物与胆汁酸的相关性不仅证实了以前的微生物胆汁酸决定因素，而且还包括额外的相关性，例如与Ruminococcussp_5_1_39BFAA和Faecalibacterium prausnitzii的相关性，这些相关性可能反映了细菌对胆汁酸的转化，或者相反，通过胆汁酸的抑菌作用。值得注意的是，我们只关注最突出的胆汁酸物种。在未来，还将有兴趣评估较少的次级胆汁酸的决定因素，例如最近显示的LCA代谢物3-oxo-LCA和iso-LCA，它们可以控制结肠固有层中的T细胞分化，从而调节适应性免疫。

我们还研究了胆汁酸在多大程度上与肥胖相关疾病相关，包括肝脏脂肪含量、糖尿病、高血压和血脂异常（在控制了年龄和性别之后）。在FDR<0.05时，该分析确定了7个胆汁酸与糖尿病相关，6个胆汁酸与肝脏脂肪含量相关，5个胆汁酸与高血压相关。其中大多数实际上与细菌来源的胆汁酸有关，特别是总的次级胆汁酸、DCA、GDCA和TDCA。胆汁酸-肝脂肪含量的相关性证实了胆汁酸在肥胖患者NAFLD病因中的作用。有趣的是，我们观察到，表达胆碱基甘氨酸水解酶基因的Ruminococcus sp_5_1_39BFAA不仅与细菌胆汁酸有关，而且与肝脏脂肪含量有关。这些结果支持了Ruminococcus sp_5_1_39BFAA可能通过共同调节肠道BA代谢促进NAFLD的假说。此外，我们观察到F. prausnitzii（一种丁酸盐生产菌）的丰度与粪便中iso-LCA浓度和肝脏脂肪含量呈负相关。在细菌膜形成过程中发挥重要作用的CDP-二酰基甘油生物合成途径与粪便中iso-LCA浓度呈负相关，提示iso-LCA可能作为抑菌剂抑制了这些抗NAFLD菌的生长。

重要的是，我们的研究确定了胆汁酸与疾病相关的血浆脂蛋白特性之间的111个联系，这支持了胆汁酸在调节人体脂质代谢中的重要作用。有趣的是，我们发现空腹C4与不同大小的含VLDL的甘油三酯呈正相关，这表明这种关系源于VLDL的产生过程，而不是血浆中VLDL去脂级联的调节。肥胖受试者肝脏VLDL生成增加可能与肝脏胰岛素抵抗有关，但胆汁酸本身也被证明抑制肝脏VLDL的产生过程。干扰FXR介导的肝脏新生脂肪生成的调节可能有助于这些作用。

结论

总之，本研究揭示了遗传和微生物组对人类肥胖血浆和粪便钡实体的贡献。在血浆胆汁酸中观察到的令人惊讶的巨大个体间差异突出表明，在设计以胆汁酸信号通路为目标的未来治疗策略的研究中，应考虑遗传和微生物决定因素。特别是，在这些肥胖受试者中观察到的微生物组源性次级胆汁酸与肝脏脂肪含量、糖尿病和高血压之间的广泛相关性，以及将次级胆汁酸与肠道免疫联系起来的最新报告，强调我们的微生物第二基因组在确定个人胆汁酸池的生物活性方面的重要性。此外，肥胖受试者血浆C4与循环含甘油三酯的脂蛋白和特异性低密度脂蛋白特征之间的强烈相关性值得在NAFLD治疗中干扰人体胆汁酸代谢时进行专门的评估。事实上，与低合成率的受试者相比，具有高初始胆汁酸合成率（高C4）的受试者对FXR激动剂的血浆和肝脏脂质参数的反应更明显。鉴于肥胖受试者（即使用FXR或TGR5调节剂进行药物干预的目标人群）中胆汁酸浓度和成分的个体间差异非常大，重要的是要确定评估人类FXR和TGR5的基础激活状态的措施，以便设计有效的个性化治疗。