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编译：YQ，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 转录因子（TFs）是一种结合DNA的蛋白质，在基础生物学进程中发挥重要作用，包括细胞分化、信号转导、应激反应等。转录因子通过与靶基因的启动子结合激活/抑制靶基因表达，或进行翻译后修饰（PTMs）响应发育变化。翻译后修饰机制包括乙酰化、磷酸化、泛素化/类泛素化、亚硝基化，这些修饰影响转录因子蛋白稳定性和DNA结合活性，从而影响其对靶基因的调控。 研究表明转录因子的氧化还原修饰在应激反应中发挥重要作用，蛋白质在应激条件下容易氧化损伤，而氧化蛋白在一定条件下可修复。拟南芥AtTCP15、AtbZIP16、AtbZIP68、AtGBF1的氧化修饰显著降低其DNA结合活性，而氧化的AtBZR1促进与AtARF6和AtPIF4的相互作用，增强转录活性。硫氧还蛋白介导的NPR1氧化还原修饰改变其亚细胞定位并调节植株抗病性。氧化还原修饰主要与蛋白质中半胱氨酸氧化或巯基与二硫键之间的转换有关。蛋白质中的甲硫氨酸也受氧化修饰，及磺化氧化作用（Met-SO），可被Met亚砜还原酶（MsrA/B）修复。 番茄（Solanum lycopersicum）是重要经济作物之一。番茄果实二倍体遗传简便、全基因组注释清晰、生活史短，是研究果实成熟机制的良好模式植物。在番茄中，NOR转录因子调控乙烯通路，从而调控果实成熟。酵母双杂交系统发现Met亚砜还原酶与NOR转录因子互作。本研究表明NOR是Met亚砜还原酶的靶蛋白，氧化作用降低NOR转录因子的DNA结合能力，抑制番茄果实成熟。 论文ID 原名：Redox Regulation of the NOR Transcription Factor Is Involved in the Regulation of Fruit Ripening in Tomato 译名：NOR转录因子的氧化还原修饰调控番茄果实成熟 期刊：Plant Physiology IF：6.902 发表时间：2020年6月 通讯作者：段学武 通讯作者单位：中国科学院华南植物园 DOI号：10.1104/pp.20.00070 实验设计 结果 果皮呈红色是番茄果实成熟的重要特征。番茄果实在开花期后39d呈红色（图1A），乙烯水平快速增加（图1B），番茄红素积累（图1C）。果实开裂阶段过氧化氢积累显著增加，蛋白质羰基含量迅速增加（图1D-E）。因此，活性氧积累和蛋白质氧化还原状态可能与番茄果实成熟有关。酵母双杂交显示NOR转录因子与SlMsrB2（Met亚砜还原酶）相互作用，果实成熟过程中SlMsrB1和SlMsrB2表达上调，E4和SlMsrB2表达上调幅度远高于其他Msr基因，NOR与SlMsrB2的表达模式相似（图1F）。因此，SlMsrB2可能与NOR相互作用，调控番茄果实成熟。 图1.番茄果实的成熟特性。A：番茄果实成熟表型；B-E：番茄果实成熟过程的乙烯产量、番茄红素含量、H2O2含量、蛋白质羰基含量；F：SlMsr和NOR基因表达谱。 2 NOR是E4和SlMsrB2的靶蛋白 酵母双杂交显示E4或SlMsrB2与NOR的共转化酵母细胞在培养基上生长良好（图2A），pull-down分析显示GST-E4或GST-SlMsrB2拉低His-NOR条带（图2B），说明它们存在物理相互作用。双分子荧光互补和免疫共沉淀分析表明NOR与E4或SlMsrB2在体内的互作（图2C-D）。 凝胶阻滞分析表明添加E4和SlMsrB2可以有效地还原氧化后的NOR（图3A），LC-MS/MS分析显示NOR蛋白的8个甲硫氨酸残基中，Met-138、Met-192、Met-229、Met-293经过E4和SlMsrB2修复后氧化态显著下降，且E4似乎在Met-229和Met-293的还原中发挥重要作用（图3B）。提取p35S:NOR-GFP转基因果实的总蛋白，可鉴定出未氧化和氧化Met-138的NOR蛋白（图3C），说明番茄果实成熟过程中，活性氧诱导NOR蛋白的Met-138发生磺化氧化。 图2. NOR在体内或体外与E4或SlMsrB2的相互作用。A：酵母双杂交系统；B：pull-down分析；C：双分子荧光互补分析，黄色荧光为互作信号，蓝色荧光为叶绿素信号；D：免疫共沉淀分析。 图3 .E4和SlMsrB2调节NOR的氧化还原状态。A：氧化NOR的电泳迁移分析；B：E4和SlMsrB2降低NOR甲硫氨酸残基的氧化；C：NOR蛋白的质谱分析，含氧化Met-138的多肽红色标出。 3 NOR氧化后降低其DNA结合能力和转录调控活性 采用电泳迁移分析（EMSA）氧化NOR的DNA结合活性，结果显示His-NOR与NAM/ATAF1/2/CUC2核心基序紧密结合，导致条带向上移动，而His-NOR的氧化修饰显著降低NOR的DNA结合能力（图4A）。NOR蛋白含8个甲硫氨酸残基，其中Met-138位于保守基序中。说明Met-138氧化可能在调控NOR功能起重要作用。对Met-138进行定点突变，会降低NOR的DNA结合活性（图4B）。双荧光素酶检测显示pBD-NOR的表达显著提高LUC报告基因表达，而Met-138的突变显著降低LUC基因表达（图4C）。序列分析显示该保守基序在不同植物的NAC基因中保守，包括拟南芥ANAC019、水稻ONAC022、番茄SlNAC1、荔枝LcNAC1、香蕉MaNAC1。将这些转录因子中的保守Met突变，其转录激活活性显著降低（图4D）。因此，Met-138影响NOR的DNA结合能力和转录调控活性。而Met-138的突变不影响NOR蛋白的亚细胞定位（图4E）。 图4. 甲硫氨酸残基氧化降低NOR的DNA结合活性和转录调控活性。A：电泳迁移分析NOR的DNA结合能力；B：Met-138的突变抑制NOR的DNA结合活性；C：双荧光素酶检测NOR的转录激活活性；D：保守基序的Met突变显著降低其转录激活活性；E：NOR的亚细胞定位。 4 NOR的Met-138氧化抑制番茄果实成熟 在NOR突变体中制备了过表达NOR或NORM138Q（Met-138位点氧化）的转基因番茄植株。结果显示NOR突变体果实不能正常成熟，乙烯和番茄红素含量下降（图5A-C）。NOR过表达的果实恢复果实成熟表型，而NORM138Q转基因株恢复部分表型，但乙烯和番茄红素含量下降。所有的转基因果实中叶绿素正常降解（图5D）。 RNA-seq比较转基因果实转录组，及NOR突变体、NOR过表达株、NORM138Q。与NOR突变体果实相比，NOR和NORM138Q果实中有2030和1638个基因表达上调，1744和844个基因表达下调（图6）。KEGG分析显示上调和下调的基因主要富集于代谢途径、次生代谢产物的生物合成、植物激素信号和MAPK信号。NOR的氧化抑制乙烯信号转导、油菜素类固醇合成、类胡萝卜素合成、细胞壁降解的关键基因表达。 图5. NOR的Met-138氧化抑制番茄果实成熟。A：NOR突变体、过表达、Met-138位点氧化的果实成熟表型；B-D：果实成熟过程的番茄红素含量、乙烯产率、叶绿素含量。 图6. NOR的Met-138氧化影响番茄果实成熟相关基因表达。A-B：NOR突变体、过表达、Met-138位点氧化的果实差异表达基因数；C-D：差异表达基因的KEGG通路分析；E：RT-qPCR验证RNA-seq结果；F：果实成熟相关的基因表达谱。 5 NOR的Met-138氧化抑制其DNA结合能力和转录激活活性 选择NORM138Q抑制的12个基因（ACO1、ACS2、ACS4、PG2a、PL、CEL2、EXP1、Ggpps2、PSY1、ETR1b、YLS4、SGR1）进行分析。这些基因参与乙烯合成、细胞壁降解、类胡萝卜素合成、叶绿素降解。RT-qPCR分析显示，与NORM138Q果实相比，这些成熟相关基因在NOR过表达株的表达显著增加（图7A）。染色质免疫沉淀反应显示NOR与这些成熟相关基因的启动子相互作用（图7B）。双荧光素酶检测显示Met-138氧化降低NOR的转录激活活性（图7C）。 图7. Met-138氧化降低NOR的DNA结合活性和转录活性。A：12个成熟相关基因的表达水平；B：NOR或NORM138Q与12个基因启动子的结合活性；C：双荧光素酶检测NOR或NORM138Q对12个基因转录活性的影响。 6 E4和SlMsrB2是NOR的靶基因 RNA-seq和RT-qPCR分析显示，与NOR突变体相比，NOR过表达株和NORM138Q中E4和SlMsrB2表达上调（图8A）。染色质免疫沉淀反应表明NOR与E4和SlMsrB2的启动子相互作用，Met-138的氧化降低相互作用（图8B）。双荧光素酶分析证实NOR激活E4和SlMsrB2的启动子活性（图8C）。因此，NOR通过结合E4和SlMsrB2的启动子激活其表达。 图8 .NOR对E4和SlMsrB2的调控。A：E4和SlMsrB2基因表达水平；B：NOR与E4、SlMsrB2启动子的结合活性；C：NOR对E4、SlMsrB2启动子的转录激活活性。 结论 研究表明Met（甲硫氨酸）氧化会改变蛋白质活性或功能。酵母中的Met还原酶MXR2通过降低Met氧化调节线粒体Hsp70辅酶Mge1，恢复Mge1活性。小麦中Met氧化导致血红素氧合酶失活，其活性可通过TaMsrA4.1还原而恢复。研究表明Met氧化可增强LcNAC13和LcWRKY1的DNA结合活性，而本研究发现Met氧化导致导致NOR转录因子的DNA结合能力丧失，可通过E4和SlMsrB2的表达而恢复。 NOR是一种NAC族转录因子，在番茄果实成熟过程中起作用。NOR调控乙烯通路，包括氨基环丙烷羧酸（ACO）、聚半乳糖醛酸酶（PG2）、果胶酸裂解酶（PL）、八氢番茄红素合成酶（PSY1）、胡萝卜素异构酶（Z-ISO）、查耳酮合酶（CHS1）等。NOR的突变可以影响多种代谢过程，延迟果实成熟期。RNA-seq分析表明NOR突变导致一些乙烯合成和信号转导、类胡萝卜素合成、细胞壁降解的关键基因下调。在番茄果实成熟过程中，NOR自身表达也受其他转录因子调控。NOR是番茄MADS转录因子（成熟抑制剂）的靶标。SlAREB1可介导ABA信号通路激活NOR转录，最终促进乙烯合成。SlNAP2是一种控制衰老的转录因子，作用于NOR的上游，调节NOR表达。 本研究描述了植物中转录因子的翻译后修饰机制，表明NOR转录因子的氧化调节成熟相关基因的转录，从而调控番茄果实成熟。NOR中的Met氧化作用导致成熟相关基因的转录水平下降，从而延缓番茄果实的成熟，而E4和SlMsrB2能修复Met氧化（图9）。 图9. 番茄果实成熟过程中NOR氧化还原调控网络模型。 更多推荐 1 科研 | PLANT CELL：导入蛋白及其两种拮抗物质对根分生组织中PLETHORA1的转录调控（国人佳作）
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