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WGBS跟RRBS如何选择？表观DNA甲基化和转录调控结果关联思路 前几天，易基因推送了以RRBS技术研究结果高分见刊的SCI文章【详见：Mol Biol Evol：利用RRBS技术多维度分析人和小鼠的疾病表观遗传特征】，有朋友后台私信：到底RRBS和WGBS怎么选择呢？
恰巧查阅文献时，看到利用WGBS测序 + RNA-seq关联分析研究DNA甲基化对鸡的肌内脂肪沉积机制影响的文章，从中或许不仅可以了解WGBS和RRBS如何选择，还能从上游表观和下游转录调控结果的关联中找出新的课题思路。
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。 而DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化是基因表观遗传学的重要机制之一，参与调控基因表达和细胞分化的过程，是目前研究最充分的表观遗传修饰形式。 这次给大家分享的文献题目是：The Landscape of DNA Methylation Associated With the Transcriptomic Network of Intramuscular Adipocytes Generates Insight Into Intramuscular Fat Deposition in Chicken，该文章主要将鸡的肌内前体脂肪细胞与成熟脂肪细胞进行DNA甲基化表观遗传与转录组调控数据关联分析，探究其中差异甲基化修饰与相关基因表达间的关联与潜在调控关系。
标题：The Landscape of DNA Methylation Associated With the Transcriptomic Network of Intramuscular Adipocytes Generates Insight Into Intramuscular Fat Deposition in Chicken. 时间：2020-04-02 单位：河南农业大学 期刊：Front. Cell Dev. Biol. 影响因子：IF 5.201 平台：WGBS，RNA-seq 样本：鸡
研究背景 肌内脂肪（IMF）是影响肉质的最重要因素之一，主要受遗传、营养和环境等因素影响，可通过改善口味、多汁和嫩度来改善肉质。目前已有的研究显示IMF沉积主要依赖于肌内前体脂肪细胞的分化、成熟和增殖，包括PPARG，GPAT1，ACC，CD36，AGPAT1和DGAT2、FABP、LPL、DGAT1和SCL27A1等多个基因。鸡IMF沉积的机制非常复杂，涉及许多代谢途径和相关基因，然而家禽的IMF沉积的表观遗传修饰机制，尤其是作为IMF 沉积基础的DNA甲基化修饰机制仍然缺乏研究。 研究思路 （1） 将鸡的肌内脂肪前体细胞（IMF_Pre）分离和诱导分化出成熟脂肪细胞（IMF_Ad），进行全基因组甲基化测序（WGBS），获得DNA甲基化修饰数据，并进行差异化分析。 （2） 进行转录组测序（RNA-seq），获得转录调控基因的表达量信息。 （3） 整合WGBS和RNA-seq数据结果进行富集分析，探究其中差异甲基化修饰与相关基因表达间的关联与潜在调控关系。 （4） 验证鸡肌内脂肪细胞中的DNA甲基化变化，揭示与肌内脂肪沉积相关的甲基化关键基因。 研究结果： （1）WGBS测序分析显示肌内前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞的DNA甲基化水平存在差异 通过免疫荧光染色检测发现与肌内前体脂肪细胞相比，诱导分化后成熟肌内脂肪细胞的5mC水平显著降低（图 1A、B），而5 hmC 水平则更高。同时，诱导分化后的成熟肌内脂肪细胞DNA甲基转移酶DNMT3A/3B和DNMT1的mRNA表达水平明显降低（p＜0.01，图1C）)，而在诱导分化后（从第2-4天），去甲基化酶TET1/2/3表达水平显著增加（图1C）。
图1 WGBS测序研究中，分别在肌内前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中产生了 34.43G 和 35.29 G 的原始数据，其中发现约60%的的脂肪细胞DNA甲基化属于CpG甲基化，约1.2%的甲基化属于非CpG甲基化（图2B），42.9%位于基因间区，31.25%位于内含子，16.9%位于TSS区域（图2G）。
图2 研究人员对前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞组两组数据进行整体DNA甲基化谱的差异化分析，发现了7580个差异甲基化修饰区域（Differentially Methylated Religion，DMR），DNA甲基化水平在启动子区域周围呈“V”型曲线（图3A）。与前体脂肪细胞组相比，成熟脂肪细胞组中启动子区域呈现出低甲基化水平和高全基因组表达水平（图3A、B）。此外，很大比例的DMR位于内含子和外显子区域（图3C）。将所有差异甲基化相关基因（Differentially Methylated Genes，DMG）进行GO和KEGG富集分析，结果显示DMGs主要参与骨骼系统发育（图3E）、粘着斑、脂肪酸代谢、ECM-受体相互作用和 PPAR 信号通路等功能（图3F）。
图3 （2）整合RNA-Seq和WGBS数据差异化分析提示COL6A1的甲基化水平与甘油三酯含量高度相关 研究人员在整合RNA-Seq和WGBS数据分析发现，在脂肪细胞分化过程中，有 324 个（甲基化上调、基因表达下调和338个甲基化下调、基因表达上调的DMG（图 4A）。 ① 脂质代谢相关基因，如FASN、HADHA、INSIG1、BMP4和LCLAT1（图 4B） ② 胰岛素信号转导和脂肪酸代谢相关基因：COL6A1，THBS1，LAMA2，HADHA，ACAA2，ELOVL7，ACADL，LCLAT1，INSIG1，和FOXO3（图4C） ③ 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）相关基因：INSIG1、BMP4和COL6A1（图4D） ④ IMF 含量相关基因：COL6A1和ABCA1的表达水平（r = 0.980 和 0.994，p ＜ 0.05）（图 4E） 以上基因的表达水平被认为是潜在的IMF沉积候选关键基因。采用qRT-PCR分析IMF成脂分化不同阶段候选基因的mRNA表达，发现COL6A1的mRNA水平在肌内前体脂肪细胞的成脂分化过程中显著增加，结果表明COL6A1的mRNA水平与分化过程中肌内脂肪细胞的甘油三酯（TG）含量呈高度正相关（r=0.84，p= 0.03），而ABCA1和GSTT1L与TG 含量无明显相关性（r=0.14，p=0.78和r=0.24，p=0.65）（图 4F）。
图4 根据BSP克隆测序法（Bisulfite Sequencing PCR,BSP）结果显示，COL6A1启动子区域在肌内前体脂肪细胞中呈现高高甲基化水平 (72%)，而在成熟的肌内脂肪细胞中呈现低甲基化水平 (28%)（图5A、B）。此外，研究人员发现COL6A1启动子区域的甲基化水平与mRNA水平呈明显负相关的关系（r=-0.908，p＜0.05）（图 5C）。
图5 （3）验证DNA 甲基化是否影响肌肉内脂肪生成 研究人员使用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷 (5-AZA)来处理肌内前体脂肪细胞，结果显示，在5-AZA作用下，肌内前体脂肪细胞的DNA甲基化水平对比对照组下降了60%（图6A），而油红 O染色（Oil red O staining）电镜观察显示 5-AZA 促进肌肉内脂肪生成（图 6C、D）。
图6 对COL6A1过表达和敲低的相关基因表达水平进行实验研究，结果表明：COL6A1过表达促进脂肪细胞分化和成脂相关基因（PARG，CEBPA，FABP4）的mRNA 表达水平（图7B）；相反，敲低COL6A1则会明显下调相关基因的表达水平（图7C）。EdU染色分析结果表明COL6A1促进肌内前体脂肪细胞增殖（图7E）。BODIPY染色显示，过表达的COL6A1促进肌内脂肪细胞中脂滴的形成，而在RNA干扰COL6A1后则降低了脂滴的形成（图7F）。 经过多方实验研究对比，证实了COL6A1基因能够通过促进成脂基因的表达从而加速脂肪细胞的成熟，进而肌内前体脂肪细胞成脂分化、沉积进程加快（图 7G）。
图7 易基因小结 研究目的： 研究DNA甲基化对鸡的肌内脂肪沉积机制影响，筛选影响肌内脂肪生成的候选基因。 研究结果： 1、WGBS测序分析显示肌内前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞的DNA甲基化水平存在差异。 2、RNA-Seq和WGBS数据差异化分析提示COL6A1的甲基化水平与甘油三酯含量高度相关。 3、COL6A1基因能够通过促进成脂基因的表达从而加速脂肪细胞的成熟，进而肌内前体脂肪细胞成脂分化、沉积进程加快。 易基因点评： 将WGBS测序分析的甲基化修饰水平数据与RNA-seq测序的转录调控数据进行整合，并对关联基因进行富集分析和筛选，可以挖掘其中差异甲基化修饰的潜在功能调控机制，为后续的生物实验验证增加强有力的数据支撑，提升课题研究的说服力和影响力。 文献来源：doi.org/10.3389/fcell.2020 原文解读 |
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