【原】蛋白质组学第4期文章搜库过程复现

健明 2021-07-14

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上周我们公布了，蛋白质组学习小组起飞啦！短短几天就获得了250多小伙伴的支持，让我们也更有信心的带领大家掌握一个蛋白质组学数据处理的实战，前面两期我们分享的是：

1. 实验样本

两种细胞系

OVCA429
对照组 3个技术重复
实验组 3个技术重复
OVISE
对照组 3个技术重复
实验组 3个技术重复

2. 导入数据

导入数据设置 Group Experment fraction

img

Group 如果有实验的参数设置不同，应该设置group，在不同组添加参数
同一实验的实验组和对照组experment 一样，定量输出一个文件里。
Frcation:实验分了馏分是才设置，本文没有分馏分。

3. 数据库

数据库包括

UniProt human sequence database
污染库匹配环境污染的蛋白，然后去掉，本文用两种污染库
室内污染，包括 keratins, bovine proteins detected in FCS,trypsin
支原体库（本实验流程中容易引入，根据自己实验要求定。mycoplasma proteins database from UniProt

文章中提供了数据库

（1）数据库位置 ftp://massive.ucsd.edu/MSV000079904/sequence/

img

（2）将上述两个fasta文件合并成一个文件，格式仍然是fasta格式

（3）在Maxquant中加库：

4. 搜库参数

除了设置了LFQ，其他都是采用默认参数。参考文章 The MaxQuant computational platform for mass spectrometry–based shotgun proteomics 已经放在微云盘

（1）Precursor mass tolerance was set to 4.5 ppm in the main search, and fragment mass tolerance was set to 20 ppm. 质控

（2）Digestion enzyme specificity was set to Trypsin/P with a maximum of 2 missed cleav-ages. 做实验时用了什么酶切，漏切越小越好，越准确

（3）A minimum peptide length of 7 residues was required for identification. 最小的肽段长度为7，太短的假阳性率高

（4）Up to 5 modifications per peptide were allowed; acety-lation (protein N-terminal) and oxidation (Met) were set as variable modifications, and carbamidomethyl (Cys) was set as a fixed modifi-cation. 本文中加的都是肽段常有修饰，不针对其他修饰分析

（5）No Andromeda score threshold was set for unmodified peptides. A minimum Andromeda score of 40 was required for modified peptides. 每一个鉴定到的修饰都有一个打分Andromeda score最小40，越大越好

（6）Peptide and protein false discovery rates (FDR) were both set to 1% based off a target-decoy reverse database. 假阳性率

（7）“Match between runs” based on accurate m/z and retention time was enabled with a 0.7 min match time window and 20 min alignment time window 。样本和样本之间每一个峰的洗脱时间尽量平行