【原】单细胞测序助力人体肠道类器官培养

当你的才华还撑不起你的野心时，请潜下心来，脚踏实地，跟着我们慢慢进步。不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，通过文献速递这个栏目很幸运聚集了一些小伙伴携手共进，一起成长。

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文章信息

今天分享的这一篇文章是2018年12月发表在Cell Stem Cell上的：Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition.

 总览   

作者开发了一种改良的人体肠类器官培养条件，可提高培养效率并保持其长期多向分化能力。人类小肠隐窝和类器官的scRNA-seq结果表明，在精细条件下培养的器官中可以保留体内细胞多样性。文章采用多种技术：基因表达芯片、生长因子筛选、克隆形成实验等技术揭示胰岛素样生长因子1（IGF-1）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的联用增强了人类肠道干细胞的克隆形成能力和CRISPR基因组工程效率。该组合同样能够长期培养一系列肠类器官，包括大鼠小肠类器官。本文重点介绍单细胞测序部分，主要是细胞分群注释结果。

 样本   

人：三名患者的肠病灶样本；另一名患者正常组织对照

 单细胞实验   

样本处理

• 新鲜样本：将一个病人回肠组织样本剪碎、过滤、分选除去死细胞，得到EpCAM（上皮细胞粘附分子）抗体标记的细胞。

• 类器官样本：在IF（combination of IGF-1 and FGF-2 ）条件下维持超过六个月并在指定条件下扩增10天得到人回肠类器官，经单细胞解离和DAPI染色后，分选得到活的单细胞。

建库

• 10x genomics公司建库试剂盒Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit

• 测序平台：Illumina HiSeq 4000  

数据处理

基本处理

使用CellRanger（版本2.1.1）将序列数据比对到人类基因组（GRCh38）上；将UMI（独特分子标识符）计数矩阵导入R（版本3.5.1）并使用R包Seurat（版本2.3.4）进行处理(Satija et al., 2015) ；对于类器官数据，去除线粒体读数<1％或> 10％的所有细胞；通过Seurat包的NormalizeData函数获得对数标准化的表达值。通过Seurat包的ScaleData函数中用的负二项回归校正每个细胞的总UMI计数和线粒体读数的比例。通过使用每个细胞的总UMI计数和转录物长度标准化，从原始UMI计数获得FPKM值（转录物的每千碱基片段比对到每百万reads数）；用R包dbscan（版本1.1-2）实现DBSCAN聚类过滤掉88个非上皮细胞。

聚类和细胞类型鉴定

用Seurat包中的RunPCA函数执行线性降维；用Seurat包中的FindVariableGenes函数选择作为可变表达的基因；用Seurat软件包的FindClusters函数中建立SNN（基于共享最近邻居）模块化的集群，使用前25个主成分（PCs）构建SNN图；T-SNE图由Seurat包中的RunTSNE函数使用前25个PCs生成。

通过Wilcoxon rank sum test比较每个簇和其他簇，进行差异表达基因（DEG）分析，分析中包括scaled dispersion> 0.25且 log-normalized average expression> 0.01的基因；通过Benjamini-Hochberg方法计算FDR（假阳性率），并使用0.01的FDR阈值；对于每个簇，具有前100倍变化的DEGs被认为具有细胞类型特征，如果细胞类型特征基因在不同的簇之间重叠，则将基因分配给具有最高表达值的簇。

随机森林分类

用R包randomForest 运算

扩散拟时分析

使用新鲜隐窝和类器官中的干细胞，早期E细胞和E细胞的scRNA-seq数据。在分析之前，使用R package scran（版本1.8.4）中的mnnCorrect函数执行相互最近邻（MNN）批量校正(Haghverdi et al., 2018)  。使用R bioconductor package destiny（版本2.10.2）(Angerer et al., 2016) 中的DiffusionMap函数进行扩散映射分析。

 结果   

分选细胞后用选定的因子组合进行类器官培养

细胞分群注释

单细胞结果：得到新鲜细胞2254个，类器官IF（IGF-1 and FGF-2 (IF)  ）培养细胞2872个，类器官ES（EGF and p38i ）培养3790个。左图为t-SNE聚类，右图为基因表达特征。大多数分群与已知肠细胞类型的特征性基因表达模式能够关联起来，包括 LGR5+ stem cells, cycling transit amplifying (TA) 细胞, 早期和成熟肠细胞, goblet cells,以及Paneth cells，SOX4 + / POU2F3 +簇绒细胞与早期肠内分泌细胞聚集在一起，并且激素分泌肠内分泌细胞由于其数量少而不形成明显的群。值得注意的是，IF培养的类器官含有新鲜隐窝中鉴定到的大多数细胞类型，包括LGR5 +干细胞，TA细胞，早期肠细胞，goblet细胞和M细胞，以及肠内分泌细胞。相反，ES培养的类器官主要由对应于LGR5 +干细胞，TA细胞和早期肠细胞的三种细胞类型组成（E, enterocyte; EEC, enteroendocrine; TA, transit amplifying. TA cells are classified into TA1 and TA2 based on differing cell cycle phases ）。

基因表达情况

来自IF培养的人小肠类器官的92个肠内分泌细胞中的肠内分泌相关基因的表达（log10 [FPKM + 1]。通过无监督聚类将肠内分泌细胞分为enteroendocrine cell progenitors (EEC prog.), nterochromaffin (EC) cells, L cells, and early L cells。

总结  

维持人类肠类器官中的分化细胞类型具有令人惊讶的挑战，因为它们严重依赖抑制分化的生长因子。在IF条件下，人体肠道类器官始终表现出多种分化和自我更新的能力，为了全面和直接的验证这一特征，文章首次进行了人类肠上皮的大规模scRNA-seq。scRNA-seq提供了人类成人小肠上皮细胞类型的概要，以及培养类器官常规或精制培养的条件。

与其他文章比起来，这篇文章主要利用单细胞技术进行细胞分群。