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摘 要 由镰孢菌引起的赤霉病是小麦的重要病害，其抗性比较复杂。准确可靠的鉴定和评价方法是抗性改良成功的前提。评述了小麦赤霉病抗性类型及其不同赤霉病抗性鉴定和评价方法的优缺点，重点讨论了抗性类型与抗性鉴定方法的对应性。希望对赤霉病表型鉴定、不同抗性类型的理解和评价以及抗性改良有借鉴意义。小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌[Gibberella zeae (Schw.) Petch]引起的世界性真菌病害，不仅会造成小麦产量降低，其产生的呕吐毒素（deoxynivalenol, DON）、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol, NIV）等真菌毒素还会威胁人畜健康[1]。培育抗病和抗毒素积累的品种是目前解决小麦赤霉病及其毒素污染最为可靠的策略。Schroeder和Christensen[2]首先将赤霉病抗性分为TypeⅠ和TypeⅡ两类，后来，Mesterhazy等[3]在此基础上将其扩展为5类，分别为TypeⅠ（抗侵染）、TypeⅡ（抗扩展）、TypeⅢ（抗毒素积累）、TypeⅣ（籽粒抗性）和TypeⅤ（耐病性或耐产量损失）。其中TypeⅡ和TypeⅢ 研究较多，也是较为重要的两种抗性类型，反映了产量损失和籽粒毒素的污染程度，与粮食和食品安全直接关联。关于这两类抗性已有明确的概念和度量方法[4]。准确可靠的表型鉴定是进行基因精细定位和克隆、机制解析以及抗病品种选育的前提条件，也是限制赤霉病抗性研究的一个瓶颈。已报道的赤霉病表型接种鉴定的方法有自然鉴定、孢子弥雾接种[5]、土表接种[5-6]和单花滴注法[5-7]等，其中单花滴注法比较准确和稳定，是常用的方法[8]，一般指在小麦扬花初期对穗上的一个小穗的单侧小花注射孢子液，接种后18~21 d鉴定病小穗率。此外，我们通过摸索和优化改良，提出了一种新的接种鉴定方法——基部穗轴节间注射法[9]，即在小麦抽穗后，将赤霉菌孢子液注射入穗基部节间内部，在第22~25 d鉴定病小穗率。本文主要评述了赤霉病抗性类型及其现有评价方法，并提出与抗性类型相对应的鉴定和评价方法，以期为赤霉病表型鉴定、遗传改良以及抗性机制解析提供参考。TypeⅠ抗性反映小麦抵御病原菌初侵染的能力，可理解为在适宜的温湿度条件下，病原菌与寄主直接接触时，寄主阻止病原菌在小穗或小花上定殖的能力。一般用孢子弥雾接种或（和）病粒土表接种来模拟自然条件下病原菌的侵染条件。关于TypeⅠ的度量方法，有学者建议用病穗率（percentage of infected spikes, PIS）或感染小穗率（percentage of diseased spikelets, PDS）进行评价，且衡量TypeⅠ抗性的重点在于时间点的把握，即在病害进入穗轴扩展之前鉴定，避免与TypeⅡ重叠[10-11]。鉴定时间点与病害压力有很大关系，一般来说在接种后14 d左右，如果发病快的话就需要提前。真菌毒素是小麦-赤霉菌互作过程中的毒力因子[12]，会影响赤霉菌在小麦穗中的扩展。研究表明，与野生型菌株相比，使用Tri5突变体菌株（即不能产生单端孢霉烯族毒素的菌株）接种小麦后基本不扩展或扩展得很慢[13]。因此，使用产毒缺陷型突变体来进行接种可以很大程度排除TypeⅡ的效应，从而更好地衡量TypeⅠ抗性。株高、花期长短、花药外露程度、颖壳张开程度等形态和发育特征均会影响赤霉病发病程度和感染率[14-15]。自然情况下，与株高较高的小麦植株相比，较矮的植株因与土表的病原菌距离更近，赤霉病发病情况往往会更严重[3, 14]。但是这并不属于形态学上的抗性，因为这些特征不会在感染后抑制病原菌，而是帮助植物逃避病原菌，降低入侵的可能性或几率，即避病性[16]。随机性较大，不属于抗性的范畴，所以不应与TypeⅠ抗性混为一谈。在活体营养型病原体（如锈菌和白粉菌）与寄主的互作中，抗侵入意味着寄主对病原菌产生免疫或近免疫反应[17-18]。而引起赤霉病的禾谷镰孢菌是半活体营养型病原体[14]，如果温度、湿度等环境条件适宜且小穗发育时期处在敏感时期，任何一个小穗都会发病，并不存在免疫类型小麦品种。如果TypeⅠ是真实存在的，这种抗性理论上是可遗传的，意味着不同品种之间可能存在差异，但纯系类个体之间的反应型是基本一致或相似的，截至目前还没有实验和数据支撑上述推断。当然，也不能据此排除品种在抗侵染方面可能存在的差异。因此，关于寄主介导的赤霉病TypeⅠ抗性的机制以及鉴定和评价方法仍需探索。TypeⅡ 抗性指小麦抵抗赤霉菌在穗部扩展的能力，以接种后每穗感病小穗数占总小穗数的百分比，即病小穗率（percentage of symptomatic spikelets, PSS）为衡量指标。因其比其他抗性重要且更为稳定和易于评价，所以研究报道最多[19]。用于TypeⅡ抗性鉴定的经典方法是单花滴注法，该方法鉴定结果相对稳定和准确，但最好配有额外的保湿措施[8]。由于通量和接种效率较高，孢子弥雾接种和土表接种也用于TypeⅡ 抗性鉴定，不过有学者认为这两种方法反映的实际是TypeⅠ和TypeⅡ的混合效应。这两种接种方法的缺点是个体间发病差异大，表型难以准确鉴定，适合育种材料的大规模初步筛选，不推荐用于抗性表型的精准鉴定、基因的精细定位和功能解析。我们提出的基轴节间注射法[9]也可以反映赤霉病的抗扩展性，该法最大的优点是无需保湿措施，接种时间弹性较大（抽穗后-扬花期-灌浆早期），穗轴注射法的侵染路径是从穗轴到小穗，而单花滴注是从小穗到穗轴，因此与单花滴注法有很好的互补性。为了在非保湿条件下提高接种成功率和表型鉴定的准确性，我们在单花滴注法的基础上发展了双花滴注法，又根据接种位置进一步将双花滴注法分为穗基部双花滴注法（接种穗下部倒数第5个小穗的双侧小花）和穗顶部双花滴注法（接种穗上部第7个小穗的双侧小花）。以Fhb1近等基因系为材料，比较了穗基部双花滴注法、穗顶部双花滴注法和基部穗轴注射法的差异，发现3种接种方法下Fhb1近等基因系间的病小穗率均达到了极显著差异（P < 0.01）。另外我们发现，对于感病品种而言，穗基部双花滴注法容易引起接种点上方小穗早枯现象；虽然顶部双花滴注法不会引起穗早枯现象，但会缩小抗、感间病小穗率的差异。因此，我们认为迷雾保湿下的穗基部双花滴注法（或穗中部单花滴注），或者穗基部双花滴注法（或穗中部单花滴注）和基部穗轴节间注射法联合使用能够增加TypeⅡ抗性鉴定的可靠性。TypeⅢ抗性指小麦抑制毒素积累或降解DON、NIV、T‐2等真菌毒素的能力，毒素也包括DON的乙酰化衍生物3‐ADON和15‐ADON及D3G等隐蔽型真菌毒素。隐蔽型真菌毒素（masked mycotoxins）被定义为特定由植物防御机制形成的源自真菌毒素的化合物[20]。同其他异源物质一样，毒素可被活体植物改变化学结构而代谢转化，但目前大部分研究发现TypeⅢ抗性只能不完全降解或减少毒素毒性[21]，且证据表明，隐蔽型毒素可在人体和动物的消化过程中逆转为DON[22]，对人体和动物仍存在潜在危害。毒素是水溶性的，可在穗部自由运输，所以一般是整穗收获再进行毒素检测。随着检测技术的发展，目前毒素检测方法主要有薄层层析法（thin‐layer chromatography, TLC）[23]、气相色谱法（gas chromatography, GC）[24]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）[25]、酶联免疫法（enzyme‐linked immunosorbent assay, ELISA）[26]等。ELISA、晶体胶或试纸条法操作简便、快速且成本较低，适用于育种材料快速筛选；GC、HPLC等仪器法精确度更高，与质谱（mass spectrum, MS）联用还可精确定量隐形毒素含量，适用于遗传研究、机制解析或精准鉴定。目前，液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography mass spectrometry, LC‐MS）[27]或高效液相色谱-质谱联用法（HPLC‐MS）[28]是实验室检测毒素含量及形态的主要手段。不同接种方法对于籽粒DON含量也有显著的影响，我们以Fhb1近等基因系为材料，同时用穗基部双花滴注法、穗顶部双花滴注法和基部穗轴注射法进行接种，收获后测定籽粒中毒素，发现基部双花滴注法下DON含量在抗、感近等基因系间无显著差异（P>0.05）；基轴节间注射法下DON含量在抗感间达到了显著水平（P<0.05，平均差值大于100 μg·kg-1），该法也表明病穗率与籽粒毒素含量之间没有必然的联系；而在顶部双花滴注法下抗、感材料间DON含量差异最大化，达极显著差异水平（P<0.01, 平均差值大于1 000 μg·kg-1）。说明毒素含量与接种方法或侵染点有很大的关系。在自然感染或迷雾鉴定条件下，侵染点是随机发生的，这可能是导致籽粒DON含量在重复间、年度间或同一基因型个体间差异比较大、波动范围宽的主要原因之一。不同接种方法或侵染点不同导致DON毒素积累差异的机制尚不明确。基部双花滴注法对感病材料来说容易导致穗早枯，适合判断抗感总体差异但不推荐用于毒素分析；而顶部接种法不会造成穗早枯现象，虽缩小了病小穗率在抗、感之间的差异，但更适合毒素含量的分析；基轴节间注射法无需额外保湿措施，既可以分析品种的总体抗、感情况，也适合毒素含量分析，可以作为赤霉病和毒素分析的有益补充方法。孢子弥雾法和土表接种法通量高，适宜大规模育种材料的鉴定，但需要多重复多环境鉴定和测定。Mesterhazy[3]于1995年提出TypeⅣ抗性，但并未对籽粒抗性进行明确的定义，也未提出具体的评价方法，此后很多研究者将病粒率（Fusarium damaged kernels, FDK）作为评价籽粒抗性的指标[29]。FDK指单花滴注或喷雾鉴定条件下，接种麦穗中被赤霉菌感染的籽粒占总穗粒数的百分比。绝大部分报道认为PSS与FDK间呈极显著正相关，且控制FDK的多数QTL与扩展抗性位点重合[30-32]，说明FDK本质上是度量扩展抗性的间接方法。我们借鉴植物抗病的概念对籽粒抗性进行了明确定义，即在适合病原菌侵染的条件下（如适宜的温度和湿度），处于同一发育时期的待评价籽粒有同等机会直接接触病原菌时籽粒本身所表现出的抗性[33]。根据此定义，我们还开发出度量籽粒抗性的评价方法[33]，具体做法是在扬花期去除待接种麦穗的中间小花以及穗顶部和穗基部退化小穗，保留小穗两侧的正常小花，在花后10 d和15 d滴注等量的赤霉菌孢子液，确保每个小花所结籽粒有均等机会接触病原菌，并保证接种的一致性，方便不同基因型籽粒间或同一基因型不同发育时期籽粒间的抗性比较。结果发现[33]，不论发育阶段和是否携带Fhb1，接种小麦籽粒的千粒重都显著下降，且令人意外的是携带Fhb1的抗病近等基因系R22W比不携带Fhb1的感病近等基因系S22V粒重下降幅度更大，这证明了Fhb1负调控籽粒抗性，或者至少说明Fhb1与TypeⅣ抗性无关。在育种工作中可以将接种前后千粒重的降幅作为度量籽粒抗性的指标，在相同病小穗率的前提下，比较接种和未接种对照籽粒间的千粒重的降幅，降幅越大，籽粒抗性越差。该抗性类型代表品种的耐赤霉病能力，以灌浆期籽粒受赤霉菌侵染后产量的损失大小为度量依据[14]。基于产量三要素（亩穗数、穗粒数和千粒重），在花后10 d和15 d接种，每亩穗数和每穗粒数已基本固定，理论上灌浆期赤霉病接种只影响粒重，因此从该角度讲可将TypeⅤ合并到TypeⅣ，简化抗性类型。综上，对于不同抗性类型，准确稳定的表型鉴定和评价方法非常关键。我们建议把TypeⅣ和 TypeⅤ合并，可将小麦赤霉病抗性类型简化为四类：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ和TypeⅣ（表1）。不 表1 小麦赤霉病抗性类型及鉴定评价方法Table 1 Resistance types and the corresponding phenotyping methods of Fusarium head blight 能将避病性与TypeⅠ抗性混为一谈，TypeⅠ抗性的本质以及鉴定和评价方法仍需探索；TypeⅡ与TypeⅢ抗性较为重要，但二者的关系复杂，育种改良中需要兼顾；籽粒毒素含量与接种方法或侵染点有很大关系；TypeⅣ与扩展抗性没有必然的联系，病粒率（FDK）不宜作为评价TypeⅣ抗性的指标。总之，对上述不同抗性本质的理解、评价方法的完善、机制的解析以及在育种过程中兼顾不同抗性仍然是未来赤霉病研究的重点。引用本文： 咸莉梅,胡怡,李磊等.浅议小麦赤霉病抗性类型与鉴定方法的对应性[J].生物技术进展,2021,11(05):554-559.
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