|
20世纪70年代，人类首次在海洋生态系统中发现微生物在塑料上的定植。随后，科学家们便开启了塑料生物降解的系统研究。但到目前为止，几乎没有有效的微生物制剂被鉴定和表征出来。这可能主要归因于微生物总是以联合体的形式发挥作用，在这一过程中不同的微生物种群参与其中，但只有少数被鉴定出来，而且大多局限于可培养的物种。大量不明和不可培养的微生物的作用被埋没和低估。测序技术和生物信息学分析的发展使得宏基因组的快速筛查成为可能。对参与塑料生物降解的微生物种群开展宏基因组学研究分析，有助于破译塑料降解微生物的群落结构，挖掘具有聚合物降解功能的基因和酶，揭示塑料生物降解机制，从而通过设计微生物群落，提高代谢活性，加快塑料降解过程。 01 塑料圈的微生物 在水生或陆地环境中任何一块塑料表面上生长的各种微生物形成一个独特的生物圈，称为塑料圈。塑料圈的微生物组成与周围环境的微生物群落有很大的不同。在塑料周围，微生物群落生长成一层薄薄的生物膜。生物膜的形成是微生物在物体表面聚集的过程，这个过程会产生胞外聚合物，促进附着，并改变基质的物理化学性质。塑料圈的微生物群落高度复杂，是从自养(如蓝藻、藻类)到异养(如细菌、真菌、原生动物)的多种微生物的聚集体。它们参与塑料降解的不同过程和代谢途径，对于破解塑料降解机理至关重要。 02 塑料生物降解过程 塑料废物首先被一些非生物因素破坏和分解，这有助于微生物的定植和生物膜的形成。微生物生物膜通过分泌胞外酶、多糖和其他有毒酸性物质来诱导塑料的物理和化学降解，产生更简单的低聚物或单体，如苯甲酸、苯甲醇、苯甲醛、羧酸、乙烯、乙苯、丙烯苯、苯酚、聚羟基丁酸酯、酮、苯乙烯和氯乙烯等。这些低聚物和单体被各种微生物同化并分解产生能量（图1）。例如，微生物对苯乙烯的降解导致其被生物转化为苯乙酰-辅酶A、丙酮酸、乙醛-2-苯乙醇和2-乙烯基粘康酸等降解代谢物。苯乙酰-辅酶A可以被微生物，如恶臭假单胞菌通过三羧酸(TCA)循环利用产生能量。  图1 塑料生物降解过程 03 宏基因组分析塑料降解微生物的优势 目前为止，已经从众多的垃圾场中发现了许多降解塑料的微生物种类，但它们所产生的酶对聚合物的降解效率很低。环境微生物学家估计，只有2%的微生物可以在实验室中培养，留下了很大比例的未培养的真菌、细菌和极端微生物未被探索。新一代测序技术和生物信息学工具的发展使我们能够通过同时处理数百万个DNA/RNA片段来筛查大量环境样本。对塑料圈的微生物进行宏基因组分析可以破解其微生物群落结构，并挖掘负责降解不同聚合物的新基因和酶。这样，未开发的微生物基因库就可以被揭示出来，为进一步的生物技术应用提供依据。 04 宏基因组分析方法 目前，宏基因组分析主要从结构和功能两个角度开展（图2）。结构宏基因组学的重点是通过对环境样本的测序来揭示特定生态位的微生物群落结构。通过一种不依赖于培养的方式提供微生物种群的分类身份，并进一步进行其他方面的探索，如识别新基因、预测基因功能及其可能参与的代谢途径；分析“塑料圈”微生物与其所在生态环境偏好之间的相互作用；揭示特定生态中微生物种群在不同时空尺度上的动态变化，并赋予个体成员在群落结构发展中的次要或主要的生态作用。功能宏基因组学的重点是从巨大的宏基因组数据库中注释基因，挖掘基因功能，然后通过异源表达，进行基于活性的筛选和功能验证。此外，对不同生态的不同塑料圈微生物进行比较基因组学研究，将有助于确定塑料降解核心微生物种群。功能宏基因组学还可以探索不同生态位中具有塑料降解潜力的微生物的适应性机制。  图2 用宏基因组学方法破解塑料圈微生物群落的结构和功能 05 塑料降解微生物宏基因组学研究进展 5.1 塑料圈微生物群落结构 塑料圈微生物群落的组成和物种丰富度受到各种时空因素，如地理位置、生态系统和季节变化的影响。此外，不同塑料的物理化学性质以及塑料降解的不同阶段也会引起相关微生物群落组成的变化。 目前的研究发现，在海洋生态系统中，塑料降解菌的核心群落由变形菌、拟杆菌、蓝细菌、蓝藻和硅藻等组成；在陆地生态系统中，真菌中曲霉、青霉的相对丰度以及细菌中芽孢杆菌和假单胞菌的相对丰度总是较高；在塑料降解昆虫大蜡螟幼虫肠道中不动杆菌、芽孢杆菌和沙雷氏菌是核心微生物种群。 不同塑料的微生物群落存在一定的关联性。例如，有研究发现食烷菌科、Cryomophaceaea和赤杆菌属的成员在聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯表面的丰度较高；嗜油菌科和Arenicellaceae菌科的成员在聚乙烯和聚丙烯中占主导地位；而拟杆菌、γ-变形菌和疣微菌门则与聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯的降解直接相关；生丝单胞菌科和赤杆菌科在聚乙烯和聚苯乙烯表面形成生物膜；交替单胞菌科、Cellvibrionaceae和海洋螺菌科的成员则对聚氯乙烯有较高的专一性。 生物膜形成的不同阶段可能有不同的微生物参与，利用不同的副产物作为底物，完成塑料降解的整个过程。一项研究发现，在聚氨酯塑料表面生物膜形成的早期阶段，玫瑰杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌以及弧菌的丰度较高，它们被认为是主要的定植者。初级定植者的积累导致底物的改变，使其适合于各种次生定植者的后续定植，如酸杆菌、放线菌、拟杆菌、β-变形菌、蓝细菌、厚壁菌、浮霉菌和疣微菌。随着时间的延长，微生物群落组成发生变化，拟杆菌和β-变形菌等次级定植者的相对丰度增加。群落结构在不同时间段从原生到次生的动态变化反映了生物膜形成的进程。 5.2 挖掘塑料降解途径中的新基因或酶 到目前为止，对“塑料圈”的宏基因组研究仍然局限于微生物群落的结构分析，根据不同物种的丰度和特异性将它们归类为“核心”、“特定”和“稀有”物种。但是，它们在塑料降解中的功能意义尚未确定。除了核心种群，这些“特殊的”和“稀有的”物种可能在塑料降解中发挥关键作用；它们中的许多可能含有能够将塑料聚合物分解成矿物的新基因或酶。例如，Ideonella sakaiensis、Thermobifida Fusca等一些菌种都能产生PET水解酶，将PET降解成低聚物和单体。然而，它们都不适合海洋环境。因此，利用这些细菌来处理海洋塑料污染是不合适的。为了解决这个问题，人们采用功能宏基因组学的研究方法，从各种微生物资源中挖掘PET水解酶同源物。根据保守的氨基酸预测，PET水解酶在海洋和陆地宏基因组中分布广泛，但有趣的是，拟杆菌和放线杆菌分别是海洋和陆地生态系统中主要的PET水解酶产生菌。同样，其他新的酶，如烷烃羟化酶、羧化酶、酯酶、脂肪酶、鞣酸酶等的鉴定也是从不同生态的宏基因组文库中进行的，这些文库来自寒冷的海洋、温泉、南极沙漠、受污染的陆地、石油泄漏区以及无脊椎动物肠道等。  图3 塑料降解为生物宏基因组学研究进展 06 展望 宏基因组研究已经在人类肠道、植物根际等不同微生物生态领域中取得了重要应用，许多微生物衍生产品也已问世。塑料圈微生物群落具有更高的复杂性，它们通过一系列代谢途径对塑料进行酶生物降解。这一生物降解过程在很大程度上受到一些生物和非生物因素的影响。靶向这两个因素，调控微生物群落组成和设计微生物遗传结构是“塑料圈”微生物组工程可以采用的两种可能策略。这种策略已经在调控人类、动物、植物和土壤环境的微生物群落组成中得到很好的实践，它包括不同的化学、细胞和分子方法。 例如，可以采用类似提供益生元的方式，使微生物更好的适应环境。不同的化学物质，如低聚糖和多糖可以影响微生物群的组成，选择性地支持塑料降解微生物的生长；甲壳素、纤维素、淀粉、糖脂、脂肽等化学物质能够充当塑料表面的生物表面活性剂，促进生物膜的形成；但随着降解的进行，碳的浓度逐渐高于氮的浓度，营养逐渐失衡。因此，补充新鲜营养(如氮和磷)会提高降解速度。另外，在生物降解过程中，pH值的剧烈变化和异常高的需氧量对微生物的活性产生了负面影响。为了避免这些环境压力，可以使用一些缓冲能力好的化学剂，将pH、温度和氧气水平调节在合适的范围内，以满足微生物的功能需求。除了提供益生元，也可以制备益生菌。益生菌不仅包括降解潜力高的微生物，也包括环境适应性更广、对各种聚合物和碳氢化合物亲和力更高的微生物。直接提供预先生长的优势菌种培养物可加速塑料聚合物的生物降解或转化。此外，将微生物群从一个塑料圈完全移植到另一个具有相似生态偏好的塑料圈，可以更容易适应新的栖息地，加速降解进程。 另外，为了解决塑料降解微生物活力低的问题，可以进行基因工程改造。随着微生物遗传学和分子生物学的发展，开发基因定制的微生物降解环境中的复杂聚合物成为可能。目前，已经有几项研究在不同细胞系统中表达PETase，如枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。然而，这些细菌系统无法在塑料垃圾堆积较多的海洋生态系统中发挥作用。因此，有研究致力于将PETase异源表达到光合作用微藻中，以适应盐化的海洋环境。另外，不同的塑料降解酶有不同的最适环境。例如从嗜热微生物中分离的角质酶，需要更高的温度(70-80ºC)，而从Ideonella sakaiensis分离的新型PETase在常温(37℃)下可以发挥作用，但耐久性较差。因此，这些候选酶需要根据它们的环境偏好性进行进一步的优化，通过蛋白质工程，即破译蛋白质的晶体结构，然后通过分子对接和模拟动力学进行合理的设计，以增强热稳定性和改善催化活性。已有研究通过突变来提高Thermobifida cellulosilytica和Thermobifida fusca来源的角质酶的PET降解酶活性；通过合理设计解决Ideonalla sakaiensis来源的PETase的不稳定性问题。尽管取得了很大的进展，但仍有一些技术障碍阻碍了它们在更大范围内的直接应用。首先，在任何塑料圈的生态竞争环境中，转基因微生物物种或菌株的定植总是困难的。此外，单个微生物物种或菌株单独降解复杂聚合物的功能也是值得怀疑的。 这有望通过修饰整个宏基因组来解决。大多数情况下，任何群落的核心微生物宏基因组几乎都是恒定的，因此进行宏基因组操纵而不是单独操纵是合理的。通过质粒的水平转移，可以对本地微生物群体进行直接的宏基因组原位修饰。例如，有研究通过E. coli HB101将携带TFDA基因(编码2，4-二氯苯氧乙酸/2-氧代谷氨酸双加氧酶)的接合质粒pRO103水平转移到土壤微生物中，从而更好地降解苯酚。此外，携带这些基因的受体微生物细胞可以通过水平基因转移充当其他微生物的供体细胞。已经有研究采用这种方法来提高土壤中聚氨酯的降解效率。此外，使用病毒或噬菌体作为基因传递载体，已经成功地应用于许多临床试验，是一种新兴的选择。 参考文献 1. Carpenter, E.J.; Smith, K.L., Jr. Plastics on the Sargasso sea surface. Science, 1972, 175(4027), 1240-1241. 2. Dussud, C.; Ghiglione, J.F. Bacterial degradation of synthetic plastics. Proceedings of the CIESM workshop monograph, monaco city, 2014, pp. 43-48. 3. Yoshida, S.; Hiraga, K.; Takehana, T.; Taniguchi, I.; Yamaji, H.; Maeda, Y.; Toyohara, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K. A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science, 2016, 351(6278), 1196-1199. 4. Alves, L.F.; Westmann, C.A.; Lovate, G.L.; de Siqueira, G.M.V.; Borelli, T.C.; Guazzaroni, M.E. Metagenomic approaches for understanding new concepts in microbial science. Int. J. Genomics, 2018, 2018, 2312987. 5. Pinto, M.; Langer, T.M.; Hüffer, T.; Hofmann, T.; Herndl, G.J. The composition of bacterial communities associated with plastic biofilms differs between different polymers and stages of biofilm succession. PLoS One, 2019, 14(6), e0217165. 6. Purohit J, Chattopadhyay A, Teli B. Metagenomic Exploration of Plastic Degrading Microbes for Biotechnological Application. Curr Genomics, 2020, 21(4): 253-270. 供稿：刘盼 编辑：李晓萌 张彤 徐娅 点击蓝字 |
|
|
