香蕉根际土壤微生物区系特征与土传枯萎病防控研究薛超Bacillus（芽孢杆菌属；地衣芽孢杆菌；有芽胞杆菌属）是健康香蕉报际土壤中的指示微生
物16SrRNA扩增与克隆文库构建选用引物27f(5''-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)与1492r(5’一
1、ACCTTGTl’ACGACTT-3’)扩增细菌16SrRNA基因全长。PCR扩增体系如表3-1，扩增条件如表3。2。PCR
产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析检测，用DNA胶回收试剂盒(AxygenBio，USA)回收约1500bp的片段。纯化后的PCR产
物由T4连接酶酶连至pMDl9一T载体，然后通过热激法导入E．coliDH5a，于含有氨苄青霉素，IPTG，x—gal的固体LB
平板培养基于37度过夜培养，然后根据蓝白斑筛选随机挑取阳性克隆，于ABI3730测序仪测序，最终每个处理获得100条序列。大肠
杆菌DH5a感受态的制备采用的是CaCl2法，具体步骤如下：挑取划线纯化后的大肠杆菌DH5a单菌落于3mLLB液体试管中，37
oC，170rmin"1震荡培养过夜。种子液按1％的接种量转接至新鲜的LB液体三角瓶中，37oC，170rmin4震荡
培养至OD600约为0．4～0．5。将三角瓶冰浴10min，使培养物冷却至0。C，期间不时摇动三角瓶。转移菌悬液至预冷且无菌的5
0mL离心管中，离心沉淀菌体细胞(5000rminl，10min，4oC)。50mL原始培养液用30mL预冷的O．1
molLdCaCl2溶液重悬细胞沉淀，冰浴30min后再次离心(5000rminl，10min，4oC)回收菌体细
胞，弃上清。50mL原始培养液用2mL预冷的0．1molL～CaCl2溶液重悬，冰上放置4h以上即为感受态细胞。4细菌
16SrRNA与真菌ITS特异性片段扩增细菌16SrRNA扩增采用16SrRNA通用引物：27f：(5''-454一adapt
er-mid—CACGGATCCGGACGGGTGAGTAACACG一3’)与533r：(5''-454一adapter-mid一
ATCG即—rACCGCGGCTGCTGCTGGCA一3’)。根据第二章的研究结果，采用引物ITS9(5''-Miseq—adapt
er-mid-GAACGCAGCRAAIIGYGA一3’)和ITS4(5''-Miseqadapter-mid—TccTCCGCT吼
玎TGA：I：ATGc一3’)扩增真菌ITS2区域对真菌区系进行研究。其中adapter是测序平台的接头与测序引物序列，mid是用
于测序时区分样品的8bp特异序列。PCR扩增体系见表3—3，扩增条件见表3—4。每个样品设置5个PCR重复，PCR产物用1．5％琼
脂糖凝胶电泳分析检测，用DNA胶回收试剂盒(AxygenBio，USA)回收目的片段。细菌16SrRNA与真菌ITS回收产物由
上海美吉生物医药科技有限公司分别于454测序平台以及Miseq测序平台测试分析。健康香蕉根际土壤细菌区系特征本研究分别通过构建1
6srRNA克隆文库与454高通量测序的方法比较了健康与发病香蕉植株根际微生物区系差异，指出了健康香蕉根际土壤细菌区系特征。两种
方法的结果都表明Bacillus是健康香蕉根际土壤中最关键的微生物类群。高通量测序的结果表明，BacillUS占健康香蕉根际土壤微
生物群落组分的2．44％，其在根际的定殖数量与病原菌在根际的定殖数量呈显著负相关关系。Bacillus是一种非常著名的植物促生微生
物，它能通过分泌抗真菌物质抑制病原菌的生长，同时还能泌出植物激素来促进植物生长(Lim，2009)。尽管如此，这与之前土豆抑病土壤
的研究结果相反，Bacillus在感病土壤中占多数(Rosenzweigetal．，2012)。这表明，受作物以及其他环境因子的
影响，健康土壤微生物区系也是千差万别的。正因为是这样，了解健康或者抑病土壤微生物区系特征是开发有效防控植物土传病害的先决步骤健康香
蕉根际土壤真菌区系特征健康与发病香蕉植株根际真菌群落差异的最关键类群是Fusarium，该类群包含了香蕉枯萎病的病原菌Foxy
sporum￡sp．cubense(FOC)。发病香蕉根际Fusarium的相对丰度显著高于健康样品，是其4．75倍，这与平板计数
的结果一致，进一步证实了Fusarium在发病香蕉根际定殖数量显著高于其在健康植株根际的定殖数量。这与之前Ling等(2010b)
的关于西瓜枯萎病的研究结果一致。这些结果说明如何降低病原菌在植株根际定殖的数量是防控土传病害的关键。另外的一些指示健康与发病植株
根际真菌区系差异的真菌类群如Conocybe，Thelebolus和Gymnopus都是自然界中普遍存在的菇类真菌，与木质素纤维素
降解有关。Mortierella是土壤中常见的真菌类群，尤其是在根表，与Penicillium，Trichoderma和Mucor
并称为根表最常见的真菌类群。小结微生物群落包括细菌与真菌区系都与植株健康状况显著相关。克隆建库测序与高通量测序法都指出，Baci
llus在健康香蕉根际的相对丰度显著高于发病样品，是指示健康与发病香蕉植株根际细菌区系差异的最主要类群。尽管如此，克隆文库测序与高
通量测序所得到的健康香蕉根际细菌区系是显著不同的，因此真菌区系研究选用高通量测序的方法进行。研究表明，Fusarium在发病香蕉根
际的相对丰度显著高于健康样品，是指示健康与发病香蕉植株根际真菌区系差异的最主要类群，高丰度的病原菌类群是发病香蕉根际微生物区系的基
本特征。BacillIlS与Fusarium呈显著负相关关系。根据以上结果推测，如果能在香蕉根际增加BacillUS的数量就能达到
降低Fusarium数量的目的，最终将有利于防控香蕉土传枯萎病。拮抗菌（Bacillusamyloliquefaciens）
基因组测序将拮抗菌基因组DNA经超声波破碎成400bp左右片段，由上海美吉生物科技有限公司于454测序平台对全基因组进行测序。去
除过短以及低质量的序列后，经Velvet以Bacillusamyloliq『uefaciensFZB42的基因组为参照序列对有
效序列进行拼接(k-mer参数设置3lbp)。拼接得到大片段(contig)再与丑amyloliquefaciensFZB4
2的基因组进行比较以确定大片段之间的相互位置，根据大片段两端的序列设计引物，经扩增测序修补缺失区，最终得到该拮抗菌的基因组完成图。
最后，通过PASTserver配合SEED数据库对拮抗菌基因组进行注释。拮抗菌Bacillusamyloliquefacien
sNJN。6是理想的防控香蕉枯萎病的拮抗菌BacillusamyloliquefaciensNJN一6即是解澱粉芽胞桿菌（芽
孢杆菌属；地衣芽孢杆菌；有芽胞杆菌属）上一章的结果表明Bacillus是健康香蕉报际土壤中的指示微生物。在本章中，我们顺利地在健康
香蕉根际分离筛选到菌株NJN一6，通过构建16SrRNA系统发育树鉴定该菌株为Bacillusamyloliquefacien
s。当我们得到菌株NJN．6的全基因组序列后，通过与已有的Bacillus属的细菌的基因组序列进行比对，进一步确认该菌株为B．a
myloliquefac把ns。Bacillus是土壤中极为常见的微生物类群，常被筛选作为生防或者促生菌(Caoeta1．，2
011；Victor,2007)。由于B．amyloliquefaciens是革兰氏阳性菌，并且能够产生孢子，对极端环境有一定的耐
受性，应用到土壤中后存活能力强，因此是理想的工业用菌(Huoeta1．，2010)。菌株NJN一6基因组的注释结果更是证明了这
点，该菌株具有91个与孢子产生以及萌发相关的基因，有助于将拮抗菌株NJN一6与有机肥制成生物有机肥施用到土壤中后发挥功能。通过基
因组比较发现，菌株NJN．6与菌株丑amylo脚uefaciensFZB42具有高度同源性。菌株FZB42是世界知名的植物促生菌
，生防菌(Cheneta1．，2009；Cheneta1．2007)。该菌株拥有巨大的基因簇可以合成脂肽类，聚酮类抗菌物质
，如表面活性素(surfactin)，杆菌抗霉素(bacillomycin)，丰原素(fengycin)，儿茶酚型嗜铁素(iro
n-siderophorebacillibactin)，大环内酯(macrolactin)，bacillaene，地非西丁(di
fficidin)等，因此该菌被认为是潜在的生防菌(Arguelles．Ariasel口，．，2009；Cheneta1．，2
009)。菌株NJN一6基因组的注释结果也表明该菌株基因组编码了43个与脂肽类物质合成相关的基因。菌株FZB42还可以合成生长素(
IAA)等促生物质，对植物具有促生作用(Cheneta1．，2007；Idriseta1．，2007)。Yuan等(20
13)对于菌株NJN一6的研究证明菌株NⅢ一6能够产生IAA，促进植物生长。以上结果都表明，菌株NJN一6是比较理想的香蕉枯萎病拮
抗菌以及香蕉促生菌，可以用于制作防控香蕉枯萎病的微生物有机肥生产。总的来说，菌株NJN．6接入土壤后能在90天内在土壤中维持一
个比较高的状态，有利于菌株NJN一6在土壤中发挥生防功能。并且90天的时间能满足大部分作物的生育期要求，即便对于长生育期作物香蕉而
言，也能满足初期营养钵育苗的时间需求，保证香蕉根系在初始发育阶段能优先与拮抗菌接触，在植物根际形成生物膜(Lieta1．．20
13)，抵御病原菌的侵扰，起到防控土传病害的作用。高通量测序结果7087到11727条不等。如图5-5所示，测序深度曲线没有达
到平台期，表明测序深度未能将样品中的所有类群都检测出来。将每个样品的序列进行随机抽样，最终细菌16SrRNA序列数为每个样品70
18条。所有序列经RDPnaPceBaye蛆anClasfifier鉴定得到28个门，62个纲，685个属。其中未被鉴定的序
列在门的水平占1．8％到13．8％，在纲的水平占52％3017．5％，在属的水平占30．6％3054．4％。微生物有机肥调
控香蕉根际土壤微生物区系如图5-8所示，相比对照处理发病植株样品(CKD),BIO处理健康的植株样品(BIOH)与对照处理健康
植株样品(CKH)根际细菌区系拥有更多相同的OTU。其中BIO处理健康植株样品与对照处理健康植株样品共同拥有48个OTU(序列比:
BIOH/CKH=7.67%/9.96%);对照处理发病植株样品与对照处理健康植株样品共同拥有40个OTU(序列比:CKD
/CKH=7.93%/8.85%)，BIO处理健康植株样品与对照处理发病植株样品共同拥有83个OTU(序列比:BIOH/C
KD=8.43%/11.89%)。BIO处理健康植株样品与对照处理健康植株样品共有的类群中最主要的类群是Bacillus(序列比
:CKH/BIOH=1.19%/3.02%)。在BIO处理健康植株样品与对照处理发病植株样品，以及BIO处理健康植株样品与对照
处理发病植株样品共有的OTU中，只有一个OTU被鉴定为Bacillus(序比:BIOH/CKD=0.21%/0.21%;CKD
/CKH=0.21%/2.13%)。Pearson相关性分析表明Bacillus在根际的定殖数量与香蕉单株以及单位小区产量呈正
比(单株产量:r=0.82，P<0.05;单位小区产量:r-0.81，P<0.05)，与发病率以及病原菌尖孢镰刀菌在根际的
定殖数量呈反比(发病率:r=-0.80,P<0.05;FOC数量:r-0.57,P<0.05)。3．3健康香蕉根际土
壤微生物区系特征通过比较对照处理中的健康与发病植株根际细菌区系来揭示健康香蕉根际土壤细菌区系特征。在门的水平，Firmicute
sActinobacteria在对照处理健康样品中比较丰富而Verrucomicrobia，Bacteroidetes，Prote
obacteria和Gemmatimonadetes在对照处理发病样品中比较丰富(t-test，P<0．05)。Bacillus是
造成对照处理中健康与发病植株根际细菌区系差异的最主要贡献者，贡献率5．5％，与AcidobacteriaGP6，Gemmatim
onas，Flavobacterium，AcidobacteriaGPI，Rhodanobac纪r，Ohtaekwangia，Sp
hingobium，Steroidobacter97Burkholderia是对照处理中健康与发病植株细菌区系差异的前十位最主
要的贡献者(附表5．2)。如图5．8所示，总共只有121个OTU(占21．44％的序列)是所有的CKH样品所共有的，其中56个O
TU(占6．45％的序列)被鉴定为Bacillus。相对的，所有的CKD样品有208个OTU(占0．21％的序列)是共享的，其中只
有一个OTU被鉴定为Bacillus。我们将所有CKH共有的OTU定义为抑病土壤的“核心微生物类群”，这些类群主要有Bacilla
ceae，Hyphomicrobiaeeae，Gaiellaceae，Bradyrhizobiaeeae，Sphingomonad
aceae，Rhodospifillaeeae，Paenibacillaceae，Nitrospiraceae和Streptom
ycetaeeae。健康香蕉根际土壤微生物区系特征除Bacillus之外，很多其他微生物也被发现是健康香蕉根际土壤的主要微生物类
群，BurkholderiaGaiellaceaePaenibacillaeeae和Streptomycetaceae。其中Gai
ellaeeae和Streptomycetaceae都属于Actinobacteria，而Actinobacteria先前已被报道
是香蕉枯萎病抑病土壤中的主要微生物类群(Pengeta1．，1999)。Pan等(1997)发现Burkholderia能在香
蕉枯萎病病原菌菌丝体与孢子表面定殖，引起菌丝体分解，孢子末端或者中间肿胀。Paenibacillaceae被发现可以产生抗真菌物质
fusaricidins，该物质可以有效抑制F．oxysporum￡sp．nevium生长(Razaeta1．，2009)。这
些类群都可以作为潜在的生防菌用来开发新型抑制香蕉枯萎病的微生物有机肥微生物有机肥生防效果有机肥作为微生物的营养来源，可以提高微生
物生物量与活性，帮助生防菌在香蕉根际的定殖(CraftandNelson，1996；Janviereta1．，2007)。
之前也有研究表明有机肥对防控枯萎病没有效果，不能降低病原菌在土壤中的数量，有时有机肥自身提供的营养甚至会刺激病原菌生长，引起病原菌
的富集(P&ez—Piquereseta1．，2006)。在第四章的研究中，我们确认了通过添加有机肥有助于拮抗菌在土壤中的定殖
。因此在本章的试验中，我们将第四章研究中筛选得到的生防菌B．amyloliquefaciensNJN．6发酵液与有机肥混合，经过
二次固体发酵后制成微生物有机肥。制成微生物有机肥使拮抗菌率先与有机肥接触，优先占领有机肥中的生态位，能够有效防止病原菌因为利用有机
肥的养分而数量暴涨，这与本章病原菌定量的结果一致。田间试验结果表明，施用微生物有机肥显著降低了香蕉的发病率，香蕉枯萎病生防效率达到
68．5％；同时，单位植株产量得到显著提升，最终获得两倍于对照处理的单位面积产量，这个结果与之前微生物有机肥在其他作物上的应用相似
。Zhao等(2011)报道了将微生物有机肥应用到防控甜瓜枯萎病中，生防率达75％，产量提升了17．4倍。Wu等(2008)报道了
用含Paenibacilluspolymyxa与Trichodermaharzianum的微生物有机肥防控西瓜枯萎病，其防控率为
75％。Qiu等(2012)用含Bacillusamylo嘶uefaciens，Paenibacilluspolymyxa与T
richodermaharzianum复配的微生物有机肥防控黄瓜枯萎病，防控率高达83％。这些研究的结果都要好于本研究的田间生防
效果，这是因为本研究对照处理的发病率还不够高，而在这些研究中，植株在对照处理中几乎都死亡，因此最终得到的生防效率非常高。另外一个原
因可能是使用多菌种复配的微生物有机肥可能具有更好的生防效果。本研究结果表明，施用Bacillus主导的微生物有机肥能够提高Bac
illus在香蕉根际定殖的概率与数量。Bacillus的丰度与病原菌的数量呈负相关关系，与发病率呈正相关关系。有益菌在香蕉幼苗根际
的定殖可以诱导香蕉产生系统抗性，有利于抵抗病原菌侵染(Kloeppereta1．，2004)。同时拮抗菌Bamylolique
faciensNJN．6在根际优先定殖，可以优先抢占生态位，也可与病原菌产生营养竞争：拮抗菌还能产生拮抗物质降低病原菌在根际的定
殖，这与先前微生物有机肥在西瓜和黄瓜上的研究结果一致(Huangeta1．，2011；Lingeta1．，2012)。凌宁
等报道生防菌可以诱导西瓜根系产生特殊分泌物来抑制西瓜枯萎病病原菌Fusariumoxysporum￡sp．niveum孢子萌发(L
ingela1．，2010a)。因此通过施用Bacillus主导的微生物有机肥能够达到提高有益菌群定殖，降低病原菌侵染的目的，
最终起到防控香蕉土传枯萎病的作用。B．amyloliquefaciens防控香蕉枯萎病还有可能是因为其对香蕉植株的促生作用。该菌被报道可以产生生长素类物质，可以促进植物根系的生长，进而增加根系分泌物以及可以给微生物提供更大的栖息场所(Yuaneta1．，2013)。另外，该菌还能产生两种抗真菌的脂肽类物质(iturin和bacillomycinD)以及18种挥发性抗菌物质进而抑制病原菌生长(Wangeta1．，2013)。综上所述，通过施用微生物有机肥在香蕉根际构建了以有益菌群Bacillus为主的微生物群落，通过直接或者间接的对病原菌的拮抗作用成功地降低了香蕉枯萎病的发病率，同时提高了香蕉的产量。小结将B．amyloliquefaciensNJN．6与氨基酸有机肥混合通过二次发酵制成BIO，并通过BIO营养钵育苗以及田间穴施BIO显著地降低了香蕉枯萎病的发病率，生防率达68％，香蕉单位面积产量较对照处理翻了一番，与此同时在香蕉根际培育了一个以拮抗菌为主导的微生物群落，降低了病原菌尖孢镰刀菌在根际的定殖数量，最终达到防控香蕉土传枯萎病的目的。生物有机肥构建新垦蕉园健康根际土壤微生物区系施肥是健康土壤微生物区系形成的第一驱动力。 |
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