昼夜节律与肿瘤

文章来源:杨柳青,石汉平.昼夜节律与肿瘤.肿瘤代谢与营养电子杂志2017,6(4):338-342

正文

昼夜节律（circadian rhythm），也称为近日节律，是生物体内具有自我调节功能、与日夜交替同步的以 24 小时为周期的一种生理节律系统。近年来，越来越多的流行病学和遗传学数据显示，昼夜节律的破坏与病理状态相关，这些病理状态包括抑郁、睡眠紊乱、代谢综合征和肿瘤等 [1]。恶性肿瘤的特征之一是细胞失控制性、失序性地增殖。由于昼夜节律钟基因与神经内分泌、免疫以及细胞周期调控密切关联，尤其是影响着细胞增殖周期和凋亡，故与肿瘤密切相关 [2]。近几年的流行病学研究把代谢节律紊乱和人体主要器官肿瘤的发生、发展联系在一起，这些肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、白血病、头颈部鳞癌和肝癌等。代谢节律紊乱会随着时间的增长而提高患癌几率。代谢节律失去稳态后不仅会促进肿瘤的发展，而且还与抗肿瘤治疗的不良预后及过早死亡相关 [3]。

1 昼夜节律与生物钟基因

1.1 昼夜节律昼夜节律是机体为了更好地适应环境，在进化过程中自然选择作用下获得的内源性适应机制，是生命活动的基本特征。哺乳动物控制昼夜节律的时钟系统称为昼夜节律生物钟，其主要由中枢生物钟系统和外周生物钟系统组成。中枢生物钟系统位于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），外界光被视网膜内在的光敏视网膜神经节细胞感知，通过视网膜 - 下丘脑通路传送到 SCN[4]。SCN 将光周期信息通过脑干网状结构、颈上神经节和上胸脊髓传送至松果腺体。在夜间，SCN 的神经元活性被大幅度抑制，驱使松果腺产生出高浓度的褪黑激素，褪黑激素是一种强有力的抗癌吲哚胺分子 [5]。SCN 接收外界光信号并向人体发出同步指令，是昼夜节律的起搏点。除调节自身组织节律外，SCN 还可以通过神经递质、内分泌和体液等途径影响外周生物钟系统。外周生物钟系统存在于肝脏、心脏、肺和肾脏等几乎所有的组织器官中，维持昼夜节律并且调节组织特异性基因的表达 [1]。外周生物钟通过中枢生物钟的控制产生与其同步的节律，并通过体液维持、调节外周节律。并且，哺乳动物的外周组织存在着独立于中枢生物钟的自主生物钟，具有自主节律性。

1.2 生物钟基因昼夜节律的生理机制同时被基因转录、信号传导和代谢反馈三方面控制，其中包括了昼夜节律生物钟基因的翻译与表达。昼夜节律性产生的分子基础来源于生物钟基因之间的协调表达。昼夜节律钟基因是生命活动的时序控制器，通过神经递质、内分泌和体液途径影响周围器官和组织，控制和调节睡眠、觉醒、代谢、内分泌、细胞增殖分裂和凋亡以及免疫等各个方面，使得器官组织和细胞水平的生命活动能够有序、协同，并呈现明显的昼夜节律。许多实验数据和临床数据表明，昼夜节律可以调控细胞周期进程，并且生物钟基因通过调控细胞的增殖和凋亡在肿瘤发生、发展与抑制方面具有重要作用 [6]。

目前，在哺乳动物中发现的生物钟基因包括：昼夜节律运动输出周期故障（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白 1（brain and muscle ARNT-like protein 1，bmal1）、周期蛋白（period，Per）家族（包括 Per1、Per2、Per3）、隐花色素（cryptochrome，Cry）家族（包括 Cry1、Cry2）、孤儿核受体 α（REV-ERBα）、视黄酸受体相关的孤儿受体 α（retinoic acid receptor-related orphan receptorα，RORα）、酪氨酸激酶 1ε（casein kinase 1ε，CK1ε）、酪氨酸激酶 1δ（ casein kinase 1δ，CK1δ）、神经元 PAS 域蛋白 2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）和永恒蛋白（timeless，Tim）等 [7, 8]。

1.3 生理机制在分子水平上，昼夜节律由多个相互影响的生物钟基因以及生物钟基因蛋白产物组成的转录 - 翻译负反馈回路维持 [9]，见图 1。不同反馈回路之间的相互作用使生物钟基因的表达出现近似24 小时为周期的震荡，随后通过输出系统调节效应器形成昼夜节律 [10]。

转录因子异二聚体 CLOCK-BMAL1 作为分子生物钟的核心调控因子，可通过多个负反馈回路对其进行调控：① CLOCK-BMAL1 通过结合生物钟基因启动子 E-box DNA 序列，上调 Per 和 Cry表达。PER、CRY 是负反馈调节的重要组件，当细胞内的 PER、CRY 蛋白升高到一定程度，便与CK1ε/δ 形成复合物运输至细胞核内抑制 CLOCKBMAL1 活性。与此同时，细胞内一部分没有结合的 PER 和 CRY 则分别被 CK1ε/δ 和磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-actived protein kinase，AMPK）磷酸化降解，从而解除对 CLOCK-BMAL1 复合物的抑制并开始新一轮转录 [11]，这是昼夜节律调控最关键的负反馈回路；② CLOCK-BMAL1 可上调节负转录因子 REV-ERBα/β，并激活正向转录因子 ROR（α、β、γ）。两者分别竞争性结合位于靶基因上的调控原件 RREDNA 序列，进而分别抑制或激活BMAL1 转录 [12, 13]，见图 2 ；③ SIRT1 回路：去乙酰化酶 1（sirtuin1，SIRT1）被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）调节，NAD 通过烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT）生成，NAD是SIRT1的底物，NAMPT 是NAD限速酶。CLOCK-BMAL1 通过结合 E-box 基因序列后上调NAMPT 表达，在细胞核外 NAMPT 生成 NAD，从而上调 SIRT1，SIRT1 进入细胞核后抑制 CLOCKBMAL1。除了上述的三条回路外，还有多条回路同时对昼夜节律进行调控。

2 抑癌基因、原癌基因与昼夜节律的相关性

2.1 生物钟基因与肿瘤肿瘤发生的根本原因是机体在基因水平上失去了对细胞生长的正常调控作用。生物钟基因可调控原癌基因、抑癌基因以及转录因子的表达 , 这使其在肿瘤发生、发展和抑制方面发挥直接或间接的作用。Per2 和 Bmal1 基因对肺癌的转移和进展起到抑制作用。生物钟基因的缺失表达会导致原癌基因 c-Myc 的表达升高与代谢紊乱 [14]。Winter SL 等 [15] 在研究散发性和家族性原发乳腺癌时发现，与正常的乳腺组织相比，Per1、Per2 基因在肿瘤组织中的表达均有明显下降，尤其是在家族性原发乳腺癌中的 Per1 表达较散发性乳腺癌标本相比有明显的下降，这表明生物钟基因的表达紊乱可能是家族性乳腺癌发病的一个重要因素。CRY2可促进 c-Myc 的泛素化和降解 [16]，PER1、PER2 在活体中均可通过促进细胞凋亡达到对乳腺癌发生的抑制，并且可以通过间接的抑制 c-Myc 转录降低肿瘤的发生风险。Clock、Per 和 Cry 的高表达与更长时间的肿瘤无转移生存具有相关性，Per3 和 Cry2共同表达的缺失与乳腺癌转移风险升高相关 [13, 17]，见表 1。

Zhao H等[18] 对246名年龄在23~79 岁的不同分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的胃癌患者进行临床研究表明，Per1 和 Per2 的表达与病理分期具有显著相关性，越高的病理分期对应的 Per1 和 Per2 的表达越低。数据显示，胃癌样本中的 Per1 和 Per2 水平均低于瘤旁组织。并且，Per1、Per2 低表达的胃癌患者的生存期显著低于 Per1、Per2 高表达的患者。Yang S 等[19] 研究发现，在 30 例肝细胞癌样本中，与瘤旁组织相比 Per1、Per2、Per3 和 Cry2 mRNA 水平在癌组织样本中有明显的下降，但 CLOCK-BMAL1、Cry1、CK1ε/δ 没有显著变化，说明 Per1、Per2、Per3 和Cry2 在肝细胞癌组织样本中的表达较低。这些基因的表达在结直肠癌和胰腺癌中也同样发现了下降。并且低水平的 Per1、Per2、Per3 和 Cry2 与患者的不良预后具有显著相关性，意味着这些基因可能与腹部恶性肿瘤的发生与发展有紧密关联 [20, 21]。

2.2 Ras Ras基因家族（K-Ras、H-Ras 和 N-Ras）分别由位于 3 条染色体上的不同基因所编码。Ras 蛋白是调节细胞生长和增殖信号通路的重要元件。Ras 变异可能引起细胞的异常增殖并导致肿瘤发生。在胰腺癌、肺癌、结肠癌等恶性肿瘤中 , Ras 基因的突变高达 30%~90%。Ras 变异可以加速细胞代谢的改变 [22]。近十年研究表明，野生型 Ras 与昼夜节律之间相互影响，而突变的 Ras 可能会潜在的改变昼夜节律。在果蝇动物实验中发现，Ras 信号通路及其下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路可以调节昼夜节律，相反地，MAPK 通路受昼夜节律震荡管理。进一步研究表明，MAPK 通路中的胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路可以直接使 CLOCK 磷酸化，从而提高生物钟基因的输出[23]。GSK3 是 Cry、Per 的调节因子并且能够控制CLOCK 的稳定性。抑制状态下的 GSK3 使 CLOCK处于稳定状态，当 GSK3 激活会导致 CLOCK 的降解。Spengler ML 等 [24] 研究表明：Ras 可以通过激活 GSK3 从而上调节 CCGs。因此可以得出结论：Ras 可以通过上调钟控基因以改变代谢节律。

2.3 LKB1/AMPK AMPK是哺乳动物细胞中高度保守的蛋白质，是代谢和能量感受器。当细胞内的AMP/ATP 比值升高时，AMPK 活化并通过下调合成代谢及促进催化氧化过程来恢复体内 ATP 的含量，维持机体的正常代谢 [25, 26]。抑癌基因肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）的蛋白产物是 AMPK的上游激酶，在很多恶性肿瘤细胞中都发现了LKB1 的突变或缺失，尤其是在非小细胞肺癌中达到了 35%[27]。研究显示，在小鼠肝脏内 AMPK 的核定位和活性与CRY1核内蛋白的丰富程度成反比。通过激活 AMPK 可以使 CRY1 磷酸化并且改变昼夜节律 [28, 29]。

此外，AMPK 还可以调节 NAMPT mRNA 含量。研究显示，转基因小鼠模型中，在代谢应激状态下，骨骼肌中 NAD 的限速酶 NAMPT 的含量随 AMPK 的升高而升高。因此，AMPK 通过升高NAMPT 的含量以激活 NAD，进而通过提高 SIRT活性而对昼夜节律进行调节 [30]。二甲双胍通过激活AMPK 来降低血糖水平，见图 3。研究发现，服用了二甲双胍的小鼠的昼夜节律周期有所缩短，其机制是 AMPK 可以促使 CK1ε/δ 磷酸化而提高活性，并进一步促进了 mPer2 降解 [31]。目前临床上应用二甲双胍和反新陈代谢疗法来进行抗肿瘤治疗的机制就是通过激活 AMPK 来改变生物钟。综上所述，LKB1 与 AMPK 的减少或缺失会改变昼夜节律震荡。

2.4 p53 p53是最重要的抑癌基因之一。其编码产物是核转录因子。当细胞发生 DNA 损伤或者原癌基因突变激活时，p53 会接到上游应激信号，在细胞内的含量随即升高，引发应激反应，促使损伤细胞的修复以及异常细胞的凋亡 [22]。当 p53 基因突变时或导致抑癌功能缺失、获得性产生致癌功能、抑制正常 p53 基因活性等，最终导致肿瘤的发生。在很多肿瘤细胞中发现了 p53 的突变或缺失，从而导致代谢异常、细胞周期调控受损和抑制细胞凋亡 [32]。研究发现，p53 表达具有昼夜节律性 [33]。Per2 可以直接调控 p53 的活性。通过突变使 Per2 失活，会使受到电离辐射的荷瘤小鼠体内的p53的堆积延迟，p53 的活化受到抑制，细胞持续增生，最终因肿瘤的发展导致死亡 [34]。Hua H 等 [35] 在肺癌荷瘤小鼠中研究发现，p53 的过表达可以改变凋亡相关基因，在 Per2 高表达的 LLC 细胞株里，p53 mRNA 和蛋白质的水平高于对照组。因此得出结论：mPer2 的过表达可以显著抑制肿瘤细胞生长，诱导肺癌小鼠肿瘤细胞的凋亡，其机制是 p53 调节线粒体信号通路。Miki T 等 [36] 研究发现，在 SCN 中，p53与 Per2 启动子结合，阻碍 Per2 启动子和 CLOCK/BMAL1 的结合并导致 Per2 的表达受到抑制，p53含量过高或过低都会对小鼠的生理行为产生相移。因此得出结论，p53 可以影响 Per2 基因和其蛋白产物的表达，并通过调节 Per2 从而对昼夜节律产生影响。两项互补性研究发现：无论是正常状态还是在基因毒性应激（genotoxic stress）下，细胞质中PER2 蛋白均可以和 p53 形成二聚体来稳定 p53 并允许其进入细胞核中 [37]。因此，p53 与 Per2 之间具有双向调节作用。

3 总结

肿瘤发生的根本原因是机体在基因水平上失去了对细胞正常生长的调控作用。昼夜节律与肿瘤之间有互相影响的关系。生物钟基因可调控原癌基因、抑癌基因以及转录因子的表达。昼夜节律在影响内分泌、免疫系统与细胞周期的同时，对肿瘤的发生和抑制相关的分子机制有待于进一步的研究。生物钟基因与细胞周期关系的进一步阐明或许有助于我们更全面地了解肿瘤的发生、发展和散播转移机制，并可将其应用在肿瘤的治疗中以提高治疗效果，例如时辰放疗 [38]。对昼夜节律认识的深入有助于在临床肿瘤的预防、诊断、治疗及预后的判断方面提供依据，并具备良好的临床应用前景。