还原型谷胱甘肽对酒精性脂肪肝斑马鱼的保肝作用研究

摘要：目的 探讨还原型谷胱甘肽片对酒精性脂肪肝（AFLD）斑马鱼模型的保肝功效。方法 选取黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼，分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000、4 000、8 000 µmol/L，同时设置对照组和模型组，除对照组外，利用2%无水乙醇诱导斑马鱼32 h建立AFLD模型，观察记录斑马鱼的死亡情况及表型，确定还原型谷胱甘肽片的最大耐受浓度（MTC）。黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼分别给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L和阳性对照药RU-21 100 µg/mL，同时设置对照组和模型组，除对照组外建立AFLD模型，采用油红O染色观察斑马鱼肝脏脂肪染色强度（S），计算还原型谷胱甘肽片的保肝功效；H&E染色观察斑马鱼肝脏病理学改变；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测白细胞介素（IL）-6、高迁移率族蛋白1b（HMGB-1b）和肿瘤坏死因子（TNF）-α mRNA表达。结果  还原型谷胱甘肽片对AFLD模型斑马鱼的MTC为2 000 μmol/L。与对照组比较，模型组S显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，还原型谷胱甘肽片1 000、2 000 µmol/L组和RU-21组S显著降低（P＜0.01、0.001）；还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L和RU-21 100 µg/mL组保肝功效分别为14%、32%、71%和48%。还原型谷胱甘肽片2 000µmol/L组肝细胞结构正常，脂肪空泡较模型组减少。与对照组比较，模型组IL-6、HMGB-1b和TNF-α mRNA表达显著增加（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L组IL-6、HMGB-1b和TNF-α mRNA表达显著降低（P＜0.01、0.001）。结论  还原型谷胱甘肽片对AFLD具有明显的保肝作用，其机制与下调IL-6、HMGB-1b和TNF-α表达有关。

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期过度酗酒引起的肝脏损伤，初期常表现为酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）、酒精性肝炎，进而可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭^［1-2］。AFLD诱导因素为大量摄入酒精，引起肝细胞内脂质蓄积量超过肝湿质量的5%，或1/3以上肝组织每单位面积发生脂肪变性，属于ALD的早期阶段^［3］。研究表明，90%重度酗酒者可发展为脂肪肝，其中30%可发展为肝纤维化，8%～20%可进展为肝硬化，ALD是肝病相关患病率及死亡率的主要原因^［4］。

临床常用皮质类固醇、己酮可可碱等治疗AFLD，虽能减轻部分临床症状，但毒副作用明显、疗效个体差异大等因素严重限制了其广泛使用。有Meta分析显示，糖皮质激素可改善重症酒精性肝炎患者短期生存率，但对轻、中型病例无明显效果^［5］。谷胱甘肽具有解毒、抗惊厥、抗血栓、抗氧化和抗动脉粥样硬化作用^［6］。谷胱甘肽的半胱氨酸侧链具有一个活性巯基，可以保护体内蛋白酶的巯基不被氧化和破坏^［7］。乙醇能够直接对各种细胞器和酶的结构和功能产生损害^［8-10］，同时也能够限制线粒体脂肪酸的β氧化，导致脂质过氧化反应，进而抑制了谷胱甘肽的生物合成，继而使其抗氧化功能减弱，酒精在体内代谢可引起氧化应激和脂质过氧化反应，两者都会导致肝细胞内部分细胞器的结构发生改变，进而引起肝细胞功能的紊乱^［11］。

还原性谷胱甘肽片在临床上主要用于慢性肝脏疾病的辅助治疗，包括病毒性、药物毒性、酒精毒性引起的肝脏损伤。但采用AFLD斑马鱼模型研究还原性谷胱甘肽片的治疗效果未见报道。与啮齿类动物相比，斑马鱼具有饲养经济、方便，容易获得足够的样本量，胚胎透明、便于显微镜下观察肝脏，有利于高通量药物筛选等独特优点^［12-14］。与此同时，斑马鱼体内拥有代谢酒精所需的关键酶，胚胎发育第4天肝脏便开始成熟，在低剂量乙醇下暴露4周可诱导形成典型的乙醇性肝病，该模型具有病理和基因表达模式^［15］。本研究利用斑马鱼模型探讨还原性谷胱甘肽片对AFLD的保肝功效，为合理指导临床用药提供参考。

1　材料

1.1　药物与主要试剂

还原型谷胱甘肽片，批号19040870，重庆药友制药有限责任公司，用标准稀释水配制成20 mmol/L母液。阳性对照：RU-21，批号25780，美国精神科学有限公司，阴凉避光保存，用超纯水配制成100 mg/mL母液，-20 ℃保存。甲基纤维素（批号079K0054V，Sigma，USA）；无水乙醇（批号20200825，国药集团化学试剂有限公司）；4%组织细胞固定液（批号20190923，Solarbio）；二甲苯（批号C10631736，上海麦克林生化科技有限公司）；PBS缓冲液（批号10C16B30，武汉博士德生物工程有限公司）；Mayer苏木素染色液（批号YH0170326）、伊红染色液（批号YH180124）、中性树脂封片剂（批号YH0170419），均购自上海依赫生物科技有限公司；软蜡（熔点54～56 ℃，批号20180108）、硬蜡（熔点62～64 ℃，批号20190628），上海华永石蜡有限公司；iTaq Universal SYBRGreen Supermix（货号1725124，Bio-rad，USA）；FastQuant RT Kit（With gDNase）试剂盒（货号KR106，TIANGEN，China）；RNA-Quick Purification Kit（RNA快速提取试剂盒）（货号RN001，YiShan Biotech，China）。

1.2　主要仪器

解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；紫外-可见光分光光度计（Nanodrop2000，Thermo，USA）；PCR仪（T100，BIO-RAD，USA）；实时荧光定量PCR仪（CFX Connect，BIO-RAD，USA）；高速冷冻离心机（PIC017/21，Thermo，USA）。

1.3　实验动物

黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼，以自然成对交配方式进行繁殖，共1 020尾，日龄为受精后5 d（5 dpf），均饲养于28 ℃的养鱼用水中（水质：每升反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为450～550 µS/cm；pH值为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO₃），来源和饲养于杭州环特生物科技股份有限公司，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（认证编号001458）的要求。

2　方法

2.1　还原型谷胱甘肽片最大耐受浓度（MTC）测定

基于文献研究^［16-17］，采用2%酒精诱导32 h，构建斑马鱼幼鱼AFLD模型。斑马鱼幼鱼形态学出现严重改变，如游动兴奋异常，出现转圈乱窜，呈现心包水肿，脊柱弯曲，卵黄囊水肿以及鱼鳔畸形等，但没有观察到死亡现象。

随机选取210尾5 dpf 黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼于六孔板中，每孔均30尾，分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000、4 000、8 000 µmol/L，同时设置对照组和模型组，每孔体积3 mL。除对照组外，其余组均给药同时用2%乙醇诱导斑马鱼32 h建立AFLD模型，观察记录斑马鱼的死亡情况及表型，确定还原型谷胱甘肽片对AFLD模型斑马鱼的MTC。

2.2　还原型谷胱甘肽片保肝功效评价

随机选取180尾5 dpf黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾。分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L，阳性对照药RU-21 100 µg/mL，同时设置对照组和模型组，每孔体积3 mL。除对照组外，其余实验组均用2%无水乙醇诱导斑马鱼建立AFLD模型，28 ℃处理32 h后，用油红O进行染色，染色后每组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，使用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件分析统计斑马鱼肝脏脂肪染色强度（S），保肝功效计算公式如下：

保肝功效＝（S_模型－S_{还原型谷胱甘肽片}）/（S_模型－S_对照）

2.3　还原型谷胱甘肽片对斑马鱼肝脏组织病理学的影响

斑马鱼给药及造模同“2.2”项，用4%组织细胞固定液固定斑马鱼，进行HE染色（固定-脱水-包埋-切片-染色），并进行病理学分析评价还原型谷胱甘肽片保肝功效。

2.4　还原型谷胱甘肽片对白细胞介素（IL）-6、高迁移率族蛋白1b（HMGB-1b）和肿瘤坏死因子（TNF）-α基因表达的影响

随机选取450尾5 dpf黑色素等位基因突变型（albino）品系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾。分别水溶给予还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L，同时设置对照组和模型组，每孔体积3 mL，设置3个平行实验。除对照组外，其余组均用2%无水乙醇诱导斑马鱼建立AFLD模型，28 ℃处理32 h后，收集各组斑马鱼样本，使用RNA快速提取试剂盒提取总RNA，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒检测β-actin、IL-6、HMGB-1b和TNF-α基因的表达。引物序列见表1。

2.5　统计学方法

数据用±s表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据均由SPSS 20.0统计软件进行处理。

3　结果

3.1　还原型谷胱甘肽片保肝MTC

还原型谷胱甘肽片在500～2 000 μmol/L浓度时，均未引起斑马鱼死亡，且与模型组状态相似。在4 000μmol/L时诱发76.7%（23/30尾）斑马鱼死亡，在8 000 μmol/L时诱发100.0%（30/30尾）斑马鱼死亡。故确定还原型谷胱甘肽片对AFLD模型斑马鱼的MTC为2 000 μmol/L。见表2。

3.2　还原型谷胱甘肽片对AFLD模型斑马鱼的保肝功效

与对照组比较，模型组S显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，还原型谷胱甘肽片1 000、2 000 µmol/L组和RU-21组S显著降低（P＜0.01、0.001）。还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L组保肝功效分别为14%、32%、71%；RU-21 100 µg/mL组保肝功效为48%。还原型谷胱甘肽片在1000、2 000 µmol/L浓度具有保肝功效。结果见表3和图1。 

3.3　病理分析还原型谷胱甘肽片保肝功效

对照组斑马鱼肝细胞结构正常，边缘清晰，肝细胞核规则清晰，细胞质丰富且无脂肪空泡；模型组肝细胞排列松散，细胞核间距大，细胞质溶解有较多的脂肪空泡（箭头所指为肝细胞空泡）。阳性对照药RU-21 100 µg/mL和还原型谷胱甘肽片2 000 µmol/L组肝细胞结构正常，脂肪空泡较模型组减少，与对照组较为相似，具有明显的保肝功效。还原型谷胱甘肽片500、1 000 µmol/L组肝细胞排列松散，且有较多脂肪空泡，与模型组较为相似，保肝功效均不明显。结果见图2。

3.4　还原型谷胱甘肽片降低IL-6、HMGB-1b和TNF-α mRNA表达

与对照组比较，模型组IL-6、HMGB-1b和TNF-α mRNA表达显著增加（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，还原型谷胱甘肽片500、1 000、2 000 µmol/L组IL-6、HMGB-1b和TNF-α mRNA表达显著降低（P＜0.01、0.001）。结果见表4。

4　讨论

保肝药大多数为降脂药物，其作用机制为减少肝内脂质沉积，抑制脂质过氧化反应，但多数降脂药在肝脏中代谢，且可能驱使血脂更集中于肝脏代谢，加重肝脏负担，使脂质蓄积进而损害肝功能^［18］。抗氧化剂S-腺苷甲硫氨酸和甜菜碱等对AFLD都具有一定的疗效，但均存在不同程度的副作用。

在人类细胞中谷胱甘肽是一种自然合成的三肽，也是一种非酶性的抗氧化剂，并且这种抗氧化剂也是通过细胞合成的^［19］。还原型谷胱甘肽通过具有活性的巯基与体内的自由基结合代谢为酸类物质，加速自由基的排泄，从而避免器官受到损伤。还原型谷胱甘肽也可以参与转丙氨基和羧甲基反应，从而达到保护肝功能的生理作用^［20］。

还原型谷胱甘肽片改善AFLD模型斑马鱼肝脏脂肪水平，改善肝脏组织病病变，具有明显的保肝功效，其主要机制可能与明显下调IL-6、HMGB-1b和TNF-α等炎症基因有关。TNF-α属于炎性介质，可对炎症反应中的生理病理过程进行干预介导，进而导致局部炎症反应；HMGB-1b是一种重要的晚期炎症介质；IL-6参与炎症反应的病理过程，其水平高低可反映炎症程度，还可促进TNF-α等炎性因子的产生而加重炎性损伤。

本研究结果表明，还原型谷胱甘肽片对AFLD斑马鱼具有明显的保肝功效，其主要机制与明显下调IL-6、HMGB-1b和TNF-α等炎症基因有关。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：葛炜炜，曹刚，吴育，陈刚，张硕．还原型谷胱甘肽对酒精性脂肪肝斑马鱼的保肝作用研究    [J]. 药物评价研究, 2021, 44(8): 1594-1599 .