膜性肾病2021研究进展

膜性肾病2021研究进展

膜性肾病（membranous nephropathy，MN）是常见的原发性肾小球疾病，是以肾小球脏层上皮细胞下免疫复合物弥漫性沉积、基底膜增厚伴钉突形成为其病理学特征，其发病的起始因素是各种原因所致的补体活化，继而形成C5b-9膜攻击复合物，引起蛋白尿。早在2009年，Richard J等提出了关于MN的诸多问题，比如，特发性膜性肾病中有多大比例是由抗PLA2R自身抗体引起的？其次，自身抗体是如何导致肾小球对蛋白质的通透性增加的？

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新型抗原的陆续发现

十余年间，除了2009以及2014年发现的两种免疫复合物靶抗原PLA2R以及THSD7A约占所有原发性（primary MN, pMN）和继发性MN (secondary MN, sMN)的60%，目前还发现六种候选抗原（表1）[1]，在未来几年内，其他抗原也有望取得类似的进展，这似乎部分回答了第一个问题。

激光显微切割和串联质谱 (MS/MS) 的检测方法在MN抗原的鉴定中至关重要[1]。考虑到大多数临床实验室不开展不常见的MN抗原的IF/IHC检测，因此MS/MS更具优势。它不仅提供了 “一站式” 方法来识别抗原，还可以用于鉴定新抗原，并且不太容易出现错误的染色结果。因此，使用活检肾脏的MS/MS可以替代免疫组化以及荧光（IHC/IF）来识别以及完成抗原鉴定。

表1

膜性肾病中已明确的以及待明确的候选抗原

今年被鉴定出的MN候选抗原包括原钙粘蛋白7 (Protocadherin 7, PCDH7)[2]、丝氨酸蛋白酶 (high-temperature requirement A serine peptidase 1，HTRA1)[3]和神经细胞粘着分子1 (neural cell adhesion molecule1, NCAM1)[4]。每种抗原相关的MN都有其特定的免疫学特征（IgG亚类）、相关疾病的模式和临床结果。

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PCDH7相关的MN患者平均年龄为63岁，约占PLA2R阴性MN患者的6.4%。大多数患者几乎没有相关的基础疾病，但约20%的患者合并恶性肿瘤病史。肾活检样本的免疫荧光显示无补体沉积。此外，在部分PCDH7相关的MN患者中观察到非肾性蛋白尿（蛋白尿<3g/天），保守治疗后可缓解。

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HTRA1相关MN平均年龄为67岁，约占PLA2R阴性MN患者的4.2%，其特征是免疫沉积物中的IgG4亚型阳性，极少合并其他疾病，但可合并抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎。并且，HTRA1抗体水平与临床活动相关。

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NCAM1被鉴定为pMN和狼疮膜性肾病（LMN）中的抗原，约占PLA2R阴性MN患者的6.6%。与pMN患者不同，NCAM1相关LMN患者较年轻，主要为女性，有狼疮病史。与EXT1和EXT2相关的LMN类似，NCAM1相关的LMN不仅限于单纯的V类LMN，而且也存在于一些患有增殖性狼疮性肾炎的LMN患者中。

此外，Pierre Ronco教授今年报道了一例接触蛋白-1（Contactin-1）相关膜性肾病[5]，该病例为慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病患者。足细胞以及神经接头处均可表达接触蛋白-1，疾病状态下该蛋白产生的自身抗体以及循环免疫复合物可同时攻击神经根以及足细胞，导致神经病以及膜性肾病发病。对于该患者予以利妥昔单抗治疗后神经系统症状好转，肾病综合征完全缓解。

因此，传统的原发以及继发性MN分类受到了质疑，这种复杂性源于抗体相关的临床发现与pMN和sMN的定义不完全一致[6]。一些明显患有sMN的患者也对PLA2R抗体呈阳性，最常见的是那些患有乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染或结节病的患者。这些患者是否为真正的sMN还是与继发性疾病同时发生PLA2R相关的MN尚不清楚。基于抗体的膜性肾病分类已经被越来越多的学者关注，Laurence H. BeckJr概括了如何根据膜性肾病的抗原指导诊断[7]。首先对于没有自身免疫疾病史的MN病例，建议进行PLA2R染色，因为它可以识别约70%的病例。对于PLA2R阴性的患者，需要结合病史、临床表现、人口统计学和免疫反应物的模式进行评估。对于有自身免疫病史 (ANA阳性或自身免疫性疾病病史) 的患者，EXT1/2、TGFBR3、NCAM1和CNTN1染色可以识别大约40%的继发性MN。SEMA3B可解释大约10%的小儿MN病例。NELL1和THSD7A阳性时需要考虑恶性肿瘤的可能性。活检中的IgG亚型以及轻链可用于鉴别诊断，必要时可采用血液学检查评估潜在的淋巴增生性疾病。在移植，感染，药物，移植物抗宿主病或免疫缺陷诱导的MN患者中，目前已知的自身抗原往往为阴性（图1）。

图1

 膜性肾病的抗原如何指导诊断

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PLA2R相关MN的潜在靶点的发现及精准发病机制的探索

今年发表于Kidney Int的一项研究比较了PLA2R相关MN患者、MCD以及健康人尿液代谢谱，发现延胡索酸盐（fumarate）是PLA2R相关MN中与MCD相比唯一表达呈现显著差异的代谢物。用高滴度MN-IgG血清纯化的IgG刺激足细胞，可降低延胡索酸水合酶的表达，并增加延胡索酸水平。这些变化与足细胞表型特征（WT1、ZO-1、Snail和纤维连接蛋白）相关分子表达的改变、足细胞层白蛋白通量的增加以及足细胞中活性氧的产生有关。然而，延胡索酸水合酶的过度表达改善了这些变化。此外，延胡索酸水合酶的敲除与MN-IgG处理表现出协同效应。因此，延胡索酸可能促进PLA2R自身免疫发生后的足细胞表型的变化。这些发现表明延胡索酸可以作为治疗PLA2R相关MN的潜在靶点[8]。

图2

 延胡索酸促进PLA2R自身免疫发生后的足细胞表型的变化

除此以外，George Haddad等人利用人足细胞建立了一个细胞培养模型，发现在补体存在的情况下，抗PLA2R1阳性的pMN患者血清或分离的IgG4可诱导突触蛋白和NEPH1的水解，导致足细胞细胞骨架的变化。特异性阻断凝集素途径可阻止突触蛋白和NEPH1的降解。抗PLA2R1 IgG4以糖基化依赖的方式直接结合甘露糖结合凝集素。并且在人群中得到了验证。如下图所示，这些结果证明了在pMN中异常糖基化IgG4激活凝集素途径并诱导足细胞损伤的机制[9]。

图3 

PLA2R相关pMN发病机制的三重打击模型。

为了明确MN状态下单细胞的转录变化，Jie Xu等人[10]使用单细胞 RNA 测序分析了6名抗 PLA2R 阳性pMN 患者和2名健康对照受试者的肾脏样本。之后通过肾脏标本的聚类分析明确了不同的细胞簇，接着进行了差异表达基因 (DEG) 的鉴定和富集分析以及观察细胞之间的相互作用。大多数肾实质细胞中的 DEG 主要富含参与炎症和免疫反应调节的基因，包括IL-17信号、TNF 信号、NOD 样受体信号和 MAPK 信号等等。此外，细胞串扰突出了系膜细胞的广泛交流，这在 pMN 发病中具有重要意义。伴有大量蛋白尿的 IMN 显示参与炎症信号通路的基因表达升高，这些信号通路可能与 IMN 进展的发病机制有关。

图4 

 通过综合单细胞 RNA 测序在抗 PLA2R 阳性 IMN 和对照受试者中进行细胞谱系分析。

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生物制剂能否担当膜性肾病治疗的重任？

继（the membranous nephropathy trial of rituximab, MENTOR）研究之后，今年有两项大型RCT结果发布 (图5)，在STARMEN研究中[11]，虽然他克莫司和利妥昔单抗（Rituximab，RTX）的序贯治疗在诱导缓解方面不如环磷酰胺（cyclophosphamide ，CTX）和类固醇联合治疗，但单剂量RTX减少了复发以及更有利于他克莫司的撤药。另一项RI-CYCLO研究[12]比较了RTX与CTX联合皮质类固醇的疗效。这项研究是目前唯一一项将RTX单药和CTX周期性治疗进行对比的头对头随机对照研究，结论显示未发现RTX与CTX方案治疗膜性肾病的疗效差异。除此以外，一项小样本研究采用磷脂酶A2受体抗体驱动的RTX治疗方案获得了更令人鼓舞的结果[13]，治疗开始12个月后，91%的患者达到免疫缓解，50%部分缓解，41%完全缓解，无其他副作用。上述证据表明CNIs和RTX（单独或联合）可诱导蛋白尿的缓解，这也许可转化为肾功能的改善。

图5

三项膜性肾病的随机对照研究

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展望

尽管取得了实质性进展，但我们对膜性肾病的理解仍有很多工作尚待完成，例如，需要进一步确定疾病的触发因素，解释为什么MN亚型出现在不同的年龄。其次，在分子水平上确定磷脂酶A2受体（PLA2R和其他抗原）的精确B细胞和T细胞表位等等，均需要更多相关研究进一步探讨。

References:

1.Ronco P, Beck L, Debiec H, Fervenza FC, Hou FF, Jha V, Sethi S, Tong A, Vivarelli M, Wetzels J. Membranous nephropathy. Nat Rev Dis Primers 2021; 7(1): 69.

2.Sethi S, Madden B, Debiec H, Morelle J, Charlesworth MC, Gross L, Negron V, Buob D, Chaudhry S, Jadoul M, Fervenza FC, Ronco P. Protocadherin 7-Associated Membranous Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2021; 32(5): 1249-1261.

3.Al-Rabadi LF, Caza T, Trivin-Avillach C, Rodan AR, Andeen N, Hayashi N, Williams B, Revelo MP, Clayton F, Abraham J, Lin E, Liou W, Zou CJ, Ramkumar N, Cummins T, Wilkey DW, Kawalit I, Herzog C, Storey A, Edmondson R, Sjoberg R, Yang T, Chien J, Merchant M, Arthur J, Klein J, Larsen C, Beck LJ. Serine Protease HTRA1 as a Novel Target Antigen in Primary Membranous Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2021.

4.Caza TN, Hassen SI, Kuperman M, Sharma SG, Dvanajscak Z, Arthur J, Edmondson R, Storey A, Herzog C, Kenan DJ, Larsen CP. Neural cell adhesion molecule 1 is a novel autoantigen in membranous lupus nephritis. Kidney Int 2021; 100(1): 171-181.

5.Plaisier E, Not A, Buob D, Ronco P, Debiec H. Contactin-1-associated membranous nephropathy: complete immunologic and clinical  remission with rituximab. Kidney Int 2021; 100(6): 1342-1344.

6.Sethi S. New 'Antigens' in Membranous Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2021; 32(2): 268-278.

 7.Caza TN, Al-Rabadi LF, Beck LJ. How Times Have Changed! A Cornucopia of Antigens for Membranous Nephropathy. Front Immunol 2021; 12: 800242.

 8.Jo HA, Hyeon JS, Yang SH, Jung Y, Ha H, Jeong CW, Kwak C, Kim Y, Lee H, Lee JP, Joo KW, Lim CS, Kim YS, Hwang GS, Kim DK. Fumarate modulates phospholipase A2 receptor autoimmunity-induced podocyte injury in membranous nephropathy. Kidney Int 2021; 99(2): 443-455.

 9.Haddad G, Lorenzen JM, Ma H, de Haan N, Seeger H, Zaghrini C, Brandt S, Kolling M, Wegmann U, Kiss B, Pal G, Gal P, Wuthrich RP, Wuhrer M, Beck LH, Salant DJ, Lambeau G, Kistler AD. Altered glycosylation of IgG4 promotes lectin complement pathway activation in anti-PLA2R1-associated membranous nephropathy. J Clin Invest 2021; 131(5).

10.Xu J, Shen C, Lin W, Meng T, Ooi JD, Eggenhuizen PJ, Tang R, Xiao G, Jin P, Ding X, Tang Y, Peng W, Nie W, Ao X, Xiao X, Zhong Y, Zhou Q. Single-Cell Profiling Reveals Transcriptional Signatures and Cell-Cell Crosstalk  in Anti-PLA2R Positive Idiopathic Membranous Nephropathy Patients. Front Immunol 2021; 12: 683330.

11.Fernandez-Juarez G, Rojas-Rivera J, Logt AV, Justino J, Sevillano A, Caravaca-Fontan F, Avila A, Rabasco C, Cabello V, Varela A, Diez M, Martin-Reyes G, Diezhandino MG, Quintana LF, Agraz I, Gomez-Martino JR, Cao M, Rodriguez-Moreno A, Rivas B, Galeano C, Bonet J, Romera A, Shabaka A, Plaisier E, Espinosa M, Egido J, Segarra A, Lambeau G, Ronco P, Wetzels J, Praga M. The STARMEN trial indicates that alternating treatment with corticosteroids and cyclophosphamide is superior to sequential treatment with tacrolimus and rituximab in primary membranous nephropathy. Kidney Int 2021; 99(4): 986-998.

12.Scolari F, Delbarba E, Santoro D, Gesualdo L, Pani A, Dallera N, Mani LY, Santostefano M, Feriozzi S, Quaglia M, Boscutti G, Ferrantelli A, Marcantoni C, Passerini P, Magistroni R, Alberici F, Ghiggeri GM, Ponticelli C, Ravani P. Rituximab or Cyclophosphamide in the Treatment of Membranous Nephropathy: The RI-CYCLO Randomized Trial. J Am Soc Nephrol 2021.

13.Delafosse M, Ponlot E, Esteve E, Ghislain L, Hanset N, Boffa JJ, Johanet C, Dahan K. Personalized phospholipase A2 receptor antibody-driven rituximab treatment strategy  in membranous nephropathy. Kidney Int 2021; 99(4): 1023-1024.

-The End-

供稿|董佳馨 朱敬凤 徐一力

审稿|徐一力 张波

编辑|金鑫 潘艳艳【江苏省人民医院肾内科】