01所需材料 ✅ 间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒(套装内含基础培养基、优级胎牛血清、成骨诱导添加物、茜素红染色液、明胶) ✅ Phosphate-Buffered Saline (1×PBS) ✅ 4%多聚甲醛溶液或10%福尔马林溶液 ✦✦ 02实验操作步骤 ❶ 加1mL 0.1%明胶到六孔板中,摇匀,使其能均匀覆盖各孔底面。 ❷ 将铺有0.1%明胶的六孔板放置在超净台或CO2培养箱至少30min。 ❸ 30min后吸去明胶即可用于接种细胞,或等待六孔板晾干再接种。 ❹ 将待诱导的间充质干细胞按照 2×104 cells/cm2的细胞密度接种于六孔板中,每孔加入2mL普通完全培养基。 ❺ 细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。 ❻ 当细胞融合度达到 70%时,小心地将孔内完全培养基吸走,向六孔板中加入2mL 间充质干细胞成骨诱导分化培养基。 ❼ 每隔3天,换用新鲜的间充质干细胞成骨诱导分化培养基。 ❽ 诱导2~4周后,视细胞的形态变化及生长情况,用茜素红进行染色。 ✦✦ 03茜素红染色 ❶ 成骨诱导分化结束后,吸去六孔板中的成骨诱导分化完全培养基,用1×PBS轻柔洗涤2~3次。 ❷ 每孔加入2mL 4%多聚甲醛溶液(或10%福尔马林),室温固定30min。 ❸ 吸去固定液,用1×PBS轻柔洗涤2~3次,确保将固定液清洗彻底。 ❹ 每孔加入2mL茜素红工作液,室温染色5~10 min。 ❺ 吸去茜素红染色液,用1×PBS轻柔洗涤2~3 次,充分洗去多余染色液。 ❻ 每孔加入2mL 1×PBS,将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。 ❼ 染色后的六孔板用封口膜封装后,置于4℃可保存2周。 |
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