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红花腊梅基因组为木兰类进化和花被片颜色发展的分子机制提供见解 期刊：The Plant Journal 发表时间：2021.10 IF:6.417  2021年10月，中南林业科技大学联合河南林科院在The Plant Journal发表了题为“The red flower wintersweet genome provides insights into the evolution of magnoliids and the molecular mechanism for tepal color development”的研究论文。本文对一种新的腊梅品种——红花腊梅的全基因组进行了高质量的测序和组装，并通过整合基因组、转录组和代谢组数据为木兰类植物的进化和花色发育的分子机制提供了新的认识。迈维代谢提供了代谢组的检测分析服务。 研究背景 腊梅(Chimonanthus praecox)起源于中国，已有1000多年的栽培历史，由于具有较高的经济价值和观赏价值被广泛栽培。梅花的整体颜色主要由中部花被片决定，通常为黄色或淡黄色。根据内花被片的颜色，腊梅品种可分为三大类: Concolor类, Intermedius类,和Patens 类。本研究前期的梅花种质资源调查中发现了一个新的梅花资源类型新的梅花资源类型Rubrum Group—花期早期和盛花期花被的内、中花被片基本上都是红色的。为了与已有的三种类型区分开来，将新梅花分类为红梅属，该新类型的发现为探索梅花花色形成机制提供了资源，也为今后利用分子标记辅助育种精确控制梅花花色提供了依据。 本研究对新发布的C. praecox 品种'Hongyun’进行了全基因组测序，基于PacBio Sequel II测序平台和Hi-C辅助组装获得了高质量的染色体水平基因组;并通过与其他6种木兰类、单子叶和双子叶以及其他代表性被子植物的基因组比较分析，重新定义木兰类的进化位置；最后基于基因组、转录组和代谢组数据探讨了梅花的着色分子机制。 研究材料与方法： 春季采集7年生红梅C. praecox 'Hongyun’的新叶进行全基因组测序。 采集C. praecox的叶、根、茎、果实和7个发育阶段的花被片进行RNA测序。 来自三个腊梅资源类型（CW，Concolor wintersweet；PW，Patens wintersweet和RW, Rubrum wintersweet）不同颜色的花被片被用于转录组和代谢组分析（n=3）。 研究思路：  研究结果： 1. 基因组测序、组装和注释-探索木兰类植物在被子植物中的系统发育位置 采用Illumina Novaseq 6000和PacBio SMRT对梅花的基因组进行测序，获得V1.0组装体，接着利用Hi-C平台锚定到11条染色体，总长度为737.03 Mb(图1)，BUSCO分析显示该基因组的完整性为95%。根据同源性和从头预测以及转录组数据，鉴定并预测了25 832个蛋白质编码基因模型，平均编码序列(CDS)长度为1256 bp，平均基因长度为9965 bp。其中 95.83%的预测蛋白编码基因可以通过公共数据库的功能注释进行定位(图1b)。  图1. Hi-C辅助组装的红梅C. praecox 'Hongyun’ V1.0染色体。(a)分辨率为200kb的Hi-C互作热图；(b) C. praecox的基因组组装与注释圈图。 腊梅的基因组为探索木兰类植物的进化状态提供了更多的数据。如图2的三棵树表明木兰类植物是双子叶植物的姐妹群，在它们的共同祖先从单子叶植物分化出来后，它们的自举支持度大于60%。随后对123个类群的1082个基因进行聚类分析得出的拓扑结构分析的结果也强烈支持木兰类植物是双子叶植物的姐妹，自举支持度大于70%。前人对木兰类植物进化位置的研究结果不一致，可能是由于不同的造树方法、ILS的存在、分类单元取样的限制以及木兰类化合物在进化早期分化迅速等原因。本研究充分考虑了可能导致木兰类植物进化定位错误的各种因素，通过多种方法的结果数据表明木兰类植物很可能是双子叶植物的姐妹。  图2.利用来自25个物种的70个单拷贝基因家族的核苷酸和氨基酸序列构建C. praecox与其他植物的系统发育树。(a)基于部分核苷酸序列串联序列比对的系统发育树；(b)基于部分核苷酸序列(左)和氨基酸序列(右)串联序列比对的系统发育树。 2. 代谢组&转录组分析-检测花被片代谢产物并鉴定调控着色的候选基因和转录因子 花被片颜色是腊梅的主要特征。例如，Concolor梅花的中部和内部花被片都是黄色的; Patens梅花的中部花被片为黄色，内花被片为红色; Rubrum梅花的中花被片和内花被片均为红色。为了了解梅花花被颜色差异，利用UPLC -MS/MS检测了这三种花（CW：Concolor wintersweet、PW：Patens wintersweet和RW：Rubrum wintersweet）在开花早期花被片的中间和内侧的黄酮类代谢产物(图5a)，检测到7种不同的花青素。与其他花青素代谢产物相比，红花被片中三种花青素苷(花青素-3- o -半乳糖苷、花青素-3- o -葡萄糖苷和花青素-3- o -芦丁苷)的含量显著高于黄花被片(图5b)，表明花青素苷导致了梅花的颜色差异。 为了进一步了解腊梅红色花被片形成的分子机制，利用与代谢组学分析相同的组织样本进行了转录组测序。根据全基因组的功能注释进一步注释了涉及类黄酮(ko00941)和花青素(ko00942)生物合成的所有基因。其中，CpANS1 (Cpr011668)在红色花被片中高度表达，而在黄色花被片中表达几乎可以忽略(图5c)。因此结合代谢组学和转录组学分析认为CpANS1是梅花红色形成的关键结构基因。  图5. C. praecox色素合成关键候选基因的鉴定。(a) 三种梅花(RW、PW和CW)早期的花被片表型；(b) RW、PW和CW花被片内(I)和中(M)部花青素的相对含量；(c)花青素生物合成途径相关结构基因表达谱（FPKM）。 为了探究CpANS1在梅花红花被片中高表达的原因，从三个不同品种中分离和克隆了CpANS1的CDSs和相应的启动子片段。测序结果显示，三个品种CpANS1基因的核心启动子区和翻译氨基酸序列没有差异，表明CpANS1启动子序列或翻译氨基酸序列的差异并不是这三个品种花色差异的原因。 在基因组水平上鉴定了99个R2R3-MYB转录因子，通过最大似然树(ML) 以拟南芥的125个MYBs为模板将这些MYB转录因子分为25个不同的亚组，通过系统进化树分析鉴定出S6亚群的两个MYBs (Cpr017300和Cpr001125)(图6a)。进一步结合系统发育分析和7个发育阶段花被片样品(图6b)转录组数据的WGCNA分析，3个MYBs被鉴定并显示与CpANS1共表达，其中Cpr017300(注释为CpMYB1)可能编码一个调控CpANS1表达的关键转录因子。红、黄花被片不同比较组的相关性分析进一步证实CpANS1表达与花青素苷呈正相关且CpMYB1可能与CpANS1呈正相关。   图6. C. praecox花青素相关R2R3-MYB候选物鉴定。(a) C. praecox (99个成员)和拟南芥(125个成员)R2R3-MYB转录因子的系统发育树；(b)红梅C. praecox 'Hongyun’的七个发育阶段表型。 3. 候选基因表达量分析及互作功能验证— 梅花着色机制：CpMYB1驱动MBW复合体对CpANS1具有激活活性 MYB作为花青素代谢途径的调控基因，其CDS或启动子的突变会影响其自身的活性，从而影响下游基因的表达。从三个不同品种（RW、PW和CW）克隆CpMYB1的CDSs发现，与RW和PW相比，在CWI和CWM转录本中都存在四个碱基(AAAG)的缺失。对于CpMYB1的CDSs，'AAAG’后的'GGA’重复次数在不同的红色花被组织中存在差异。转录组数据中的序列也通过PCR扩增得到验证。CW品种CpMYB1的CDS中'AAAG’的缺失会导致移码突变，可能导致其调节功能的丧失，并最终导致 CW品种中的花青素代谢途径终止，即使它在内部花被片中高表达。相比之下，在PW和RW中，CpMYB1在红色花被片中的表达水平高于黄色花被片，表明CpMYB1的表达水平与花被片的颜色直接相关。因此认为CpMYB1可能调控了梅花不同类群的花色差异:CpMYB1的缺失导致梅花在CW品种中失去红色，而CpMYB1的表达水平决定了梅花在PW和RW中的花被色。此外，通过克隆启动子序列还发现三个品种CpMYB1核心启动子的序列没有差异，表明可能是其他调控因子而不是启动子引起CpMYB1的特异性表达。 在大多数物种中，花青素的生物合成受MYB、bHLH和WD40 (MBW)转录因子与结构基因启动子的结合调控。通过同源性搜索获得了C. praecox基因组中bHLH和WD40的同源物分别为CpbHLH1 (Cpr015629)、CpbHLH2 (Cpr020215)、CpWDR1 (Cpr013636), 和CpWDR2 (Cpr014700) 。酵母双杂交实验表明，CpMYB1可以与CpbHLH1和CpbHLH2互作，但不能与CpWDR1和CpWDR2互作。进一步的结果表明CpbHLH1和CpWDR2之间也存在交互作用(图7b)。因此，CpbHLH1、CpWDR2和CpMYB1之间可以形成MBW络合物。 为了验证CpMYB1及其MBW复合物对CpANS1的激活活性，在矮牵牛W59 x axi花瓣上进行了过表达实验。GUS染色结果表明,CpMYB1驱动的MBW复合物对CpANS1启动子有强烈激活活性, 而Cpmyb1E201（201位氨基酸同义突变，在CDS的603位点缺失AAAG碱基导致移码突变) 则失去了激活 CpANS1 启动子的能力（图 7c）。同时还进行了烟草的过表达实验来验证CpMYB1的功能，结果表明CpMYB1和Cpmyb1E201都不能加深烟草叶片和愈伤组织的颜色；以上说明CpMYB1可能需要与C. praecox的bHLH和WD40形成一个复合物(MBW)来发挥其调控功能。  图7. CpMYB 1驱动的MBW复合体促进CpANS1的转录。(b)酵母双杂交分析CpMYB1和CpbHLH1、CpbHLH2、CpWDR1和CpWDR2之间的互作;(c) GUS活性测定。 研究总结： 本文对一种新的腊梅品种—红花腊梅C. praecox 'Hongyun’的全基因组进行了高质量的测序和组装，该基因组序列为基因组编辑和分子标记辅助育种提供了有价值的资源，并为深入了解木兰类植物的进化提供了依据。通过整合基因组、转录组和代谢组数据阐明了梅花花色发育的分子机制：发现CpANS1和转录因子CpMYB1在花被颜色发育的调控中发挥着关键作用，而CpMYB1需要与bHLH和WD40形成复合物才能充分发挥其调控功能。本研究不仅为木兰类植物进化和花色发育的分子机制提供了新的认识，而且为后续梅花的功能基因组学研究和分子育种奠定了基础。  |
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