水产动物细菌分离怎么操作

细菌是原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖。水产动物的细菌病种类多、分布广，可引起养殖水产动物大批死亡，有的细菌病给养殖生产造成极大的损失。在药店（或池塘）对发病水产动物进行准确的细菌分离是诊断和治疗细菌病的基础。本文就水产动物细菌分离方法及其注意事项作以下说明，以期为水产动物细菌病进行准确的诊断和治疗提供帮助。

一、培养基的选择

在对水产动物细菌进行分离培养前，应考虑所分离的细菌的特性，对营养要求高还是不高，选择适合其生长需要的培养基。如气单胞菌对营养要求不高，普通的培养基即可生长；链球菌对营养要求较高，在普通培养基上不长，需要营养较高的培养基。

目前，公司（利洋）提供的培养基主要是硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和脑心浸液琼脂（BHIA）（见图1）。TCBS主要用于致病性弧菌的选择性分离，TSA主要用于常见细菌的分离，如气单胞菌、诺卡氏菌、爱德华氏菌等，BHIA主要用于对营养要求较高的细菌的分离，如链球菌。

图1 公司（利洋）提供的培养皿的种类

二、细菌的分离

在对水产动物细菌病进行检查时，须对水产动物进行细菌分离培养，常用的分离培养方法是琼脂培养皿接种分离法。将细菌接种琼脂培养皿，使其在培养皿表面分散开，使个别细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落。常用的细菌分离方法有平板划线分离法和涂布培养法。

（一）平板划线分离法

左手拿琼脂培养皿，打开培养皿，使之与水平面成45度角（见图2左）；右手拿接种棒（带接种环），将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取检测材料（水产动物的肝脏、脾脏、肾脏、脑等组织）少许，划线接种于琼脂培养基上（见图2右）。划线的方法有：蛇形划线（见图3左）、区域划线（见图3右）等，选择其中一种进行划线接种。划线完毕后，将接种环灼烧灭菌，在培养皿底部标记客户名称、样品来源、分离部位及分离日期（见图4）。

图2 细菌分离的操作方式

图3 细菌分离的划线方法

图4 划线接种完毕后培养皿的标记方式

（二）涂布平板法

取一定量的组织液（如血液、腹水等）滴加在培养基表面，在用无菌的玻璃涂布棒将其均匀分散至整个培养基表面。

三、细菌的培养

接种后的培养皿，在合适的温度下恒温培养，培养温度一般为25～28℃（药店进行细菌分离培养时室温培养即可）。特殊的细菌需要低温（25℃以下）培养，如杀鲑气单胞菌、诺卡氏菌等。在培养箱中，培养皿应倒置培养，以便细菌能够更好的吸收培养基中的营养物质，利于生长。

通过对发病水产动物进行细菌分离培养，最终目的是要在培养基上形成单个菌落（见图5、图6），以便进行形态观察及后续的纯化、鉴定、保存和药敏试验等操作。

图5 采用平板划线分离法分离的细菌

图6 采用涂布平板法从腹水中分离的细菌

四、注意事项

1、根据所分离的细菌的特性，选择合适的培养基。

2、细菌分离培养的整个过程要严格无菌操作，培养基和用具须彻底灭菌；操作时必须靠近酒精灯火焰，在火焰附近操作；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。

3、接种环在灼烧灭菌后，不能立即勾取细菌材料，应在酒精灯旁冷却，防止接种环过热杀死分离培养的细菌；同时也要防止已经勾取细菌材料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。

4、划线接种时不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔，划线要直、要长、要密而不重叠，最终目的是在培养皿上长出单个菌落。

5、培养时，要在合适的温度下培养，避免因温度过高或过低导致分离不出细菌。