吸入高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响

王跃振, 李庭庭, 曹红玲, 等. 吸入高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响[J]. 临床麻醉学杂志, 2019, 35(10): 1011-1015.

目的 研究高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响及其机制。
方法 雄性SD大鼠30只,体重220～240g,随机分为三组,每组10只:假手术组(S组)、脑创伤组(T组)和氢气治疗组(H组)。S组暴露硬脑膜但不进行撞击,T组与H组通过液压颅脑损伤撞击建立大鼠创伤性脑损伤模型,H组于术后第1天起每天吸入1h高浓度氢气(42％H₂-21％O₂-37％N₂),连续7d。术后48h采用HE染色法观察脑组织病理改变，免疫组化法检测创伤周围皮质氧化应激相关蛋白MPO和HO-1含量,尼氏染色法观察尼氏小体来判断神经元状态,术后7d采用Western blot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax以及caspase-3含量。
结果 与T组比较,H组神经元损伤减轻（P＜0.05）,异常神经细胞数量减少（P＜0.05）,促凋亡蛋白bax、caspase-3及氧化应激相关蛋白MPO、HO-1含量明显降低(P＜0.05),抗凋亡蛋白bcl-2含量明显升高(P＜0.05)。
结论 高浓度氢气可减轻大鼠创伤性脑损伤,其机制可能与氢气抗凋亡以及抗氧化应激作用相关。

氢点评：虽然是高浓度吸入，每天吸入1小时，连续7天。对于氢气这种扩散能力强大的气体，在停止吸入30分钟后，身体内大多数氢气会经过呼吸释放到体外。氢气在体内持续作用的时间比较短，从药物剂量角度看，高峰浓度比较高，但是持续药物浓度并不长。如果要更有效发挥氢气的作用，应该延长给氢气的时间或给氢气的次数。

学术角度，可继续阅读后文：

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创伤性脑损伤是由于外伤、撞击等因素导致的颅脑外伤。与此同时，创伤性脑损伤也是所有国家各个年龄段致死致残的主要因素，且每年造成巨大的全球经济负担。在我国，脑外伤是导致城乡居民死亡的主要因素。目前，关于改善脑外伤预后的研究正逐渐受到关注。脑创伤区周围氧化应激与凋亡反应可能与脑外伤预后较差具有相关性。氢气具有抗氧化以及抗凋亡的作用，且这种作用具有剂量相关性。已有研究报道低浓度氢气的神经保护作用，而关于高浓度氢气是否能发挥更好的神经保护作用尚未可知。为此，本研究将探索高浓度氢气对脑外伤预后的影响及其作用机制。

研究方法

动物与分组:雄性健康成年ＳＰＦ级ＳＤ大鼠３０只，体重２２０～２４０ｇ，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供［许可证号：ＳＣＸＫ（黑）２０１３⁃００１］，禁食不禁饮。随机分为三组：假手术组（Ｓ组）、脑创伤组（Ｔ组）和氢气治疗组（Ｈ组），每组１０只。

模型制备　大鼠液压颅脑损伤模型（ＦＰＩ）是模拟脑外伤的经典模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠３０ｍｇ／ｋｇ，于头皮正中注射２％利多卡因浸润麻醉。固定大鼠头部于大鼠神经立体定向仪，正中切开头皮，暴露头骨，于颅骨前囟门后２ｍｍ，矢状缝左侧２５ｍｍ，用磨钻磨出直径为４ｍｍ的骨孔，并确保硬脑膜完好无破损。将大鼠液压颅脑损伤仪与暴露的硬脑膜紧密的连接，以牙胶密封此连接处，成为一个密闭的腔隙。待牙胶干涸后，将大鼠液压颅脑损伤仪的摆锤固定于１７°，松开摆锤固定装置，使摆锤自然下落，瞬时将液体罐内的无菌盐水冲击式作用于大鼠硬脑膜，对大鼠造成中度脑创伤，此时电脑中反馈的冲击压力在１５～２０ａｔｍ。

脑组织形态学观察术后４８ｈ每组各取５只大鼠，深麻醉下依次行生理盐水冲洗和４％多聚甲醛灌注固定，断头取脑组织置于４％多聚甲醛中４℃固定２４ｈ，常规石蜡包埋，切片（３μｍ），分别进行以下检测。（１）ＨＥ染色，取脑组织切片行脱蜡、染色、分化、复染、透明，低倍镜下（×４０）取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下（×４００）观察神经细胞损伤情况。（２）尼氏染色，切片脱蜡后在７０％乙醇中６ｍｉｎ左右，３７℃孵育，取出切片在蒸馏水中洗至无乙醇为止，置入１％甲苯胺蓝染色１５ｍｉｎ，分色，镜下控制、脱水、透明、封片，低倍镜下（×４０）取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下（×４００）观察尼氏小体。

（３）免疫组化，石蜡切片与兔抗血红素加氧酶⁃１（ＨＯ⁃１）（１∶１００）抗体、兔抗髓过氧化物酶（ＭＰＯ）（１∶２００）抗体孵育过夜。第２天孵育二抗后，室温下进行ＤＡＢ反应，脱水、透明、封片，低倍镜下（×４０）取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下（×４００）观察染色情况。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测　术后７ｄ每组取剩余５只大鼠，取脑损伤周围区皮质裂解，４℃下１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，ＢＣＡ法测定蛋白浓度。蛋白样品用１０％的ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ胶进行电泳分离、上样、电泳、转膜，分别以兔抗β⁃ａｃｔｉｎ（１∶３０００稀释液）、兔抗ｂｃｌ⁃２（１∶１０００稀释液）、兔抗ｂａｘ（１∶２５００稀释液）和兔抗ｃａｓｐａｓｅ⁃３（１∶１００００稀释液）的一抗４℃孵育过夜，次日复温后用ＴＢＳ⁃Ｔ洗膜３次，用相应二抗室温孵育１ｈ，ＴＢＳ⁃Ｔ洗膜３次，加入化学发光剂后暗室曝光，得到条带。以β⁃ａｃｔｉｎ为内参，用凝胶成像分析系统采集分析ｂｃｌ⁃２、ｂａｘ、ｃａｓｐａｓｅ⁃３条带的积分光密度值，其与相应β⁃ａｃｔｉｎ条带的积分光密度值之比作为蛋白相对含量。

改良神经功能评分　术后第１～７天，每天评估大鼠ｍＮＳＳ，内容包括提尾试验、置地活动试验、平衡木试验、反射及反常运动试验。记录各组大鼠四项评分总和，反映其神经功能损伤情况。

统计分析　采用ＳＰＳＳ２１􀆰０统计学软件进行分析。正态分布计量资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量数据方差分析。Ｐ＜０.０５为差异有统计学意义。

研究结果

ＨＥ染色　Ｓ组细胞排列整齐密集，胞质丰富，胞核完整。Ｔ组与Ｈ组细胞间隙增宽，细胞肿胀，神经元萎缩或肿胀形成核固缩。Ｈ组较Ｔ组病理改变减轻（图１）。

尼氏染色　光镜下脑组织尼氏染色后呈蓝紫色，Ｓ组可见大而数量多的尼氏小体。Ｔ组与Ｈ组尼氏小体数量减少甚至消失且形态异常。Ｈ组较Ｔ组病理改变减轻（图２）。

免疫组化　ＭＰＯ主要在细胞膜上表达，ＨＯ⁃１主要在胞浆及胞膜表达。Ｓ组ＭＰＯ与ＨＯ⁃１含量明显低于Ｔ组（Ｐ＜０.０５）；Ｈ组ＭＰＯ与ＨＯ⁃１含量明显低于Ｔ组（Ｐ＜０.０５）（图３—４）。

蛋白含量　Ｓ组脑皮质ｂａｘ和ｃａｓｐａｓｅ⁃３蛋白含量明显低于Ｔ组（Ｐ＜０.０５），ｂｃｌ⁃２蛋白含量明显高于Ｔ组（Ｐ＜０.０５）。Ｈ组脑皮质ｂａｘ和ｃａｓｐａｓｅ⁃３蛋白含量明显低于Ｔ组（Ｐ＜０.０５），ｂｃｌ⁃２蛋白含量明显高于Ｔ组（Ｐ＜０.０５）（图５）。ｍＮＳＳ评分　Ｓ组神经功能未见异常，评分基本一致。Ｔ组神经功能明显异常，但同时具有自愈趋势，恢复速度较为缓慢。Ｈ组神经功能在术后第２～５天内显著改善（Ｐ＜０.０５）（图６）。

讨　论

脑外伤预后通常与创伤区周围的氧化应激与凋亡反应相关，氧化应激是颅脑创伤后期神经功能和可塑性破坏最主要的早期启动因素。活性氧过度增加导致氧化应激，可破坏脂类、蛋白质和核酸，同时促进凋亡的发生。本研究结果显示，高浓度氢气（４２％）可明显改善脑创伤大鼠的短期预后，其机制可能为高浓度氢气显著降低创伤区周围的氧化应激反应及细胞凋亡。ＦＰＩ是模拟大鼠脑外伤的经典模型，具有和临床相似的病理生理过程。根据创伤性压力数值的不同，可将ＦＰＩ分成３种程度的损伤，分别是轻度、中度和重度。本实验采取的是中度损伤，即压力范围控制在１５～２０ａｔｍ，大鼠在术后７ｄ恢复基本的神经功能，包括运动、感觉、反射、平衡木等。根据前期研究发现，创伤后４８ｈ脑损伤程度最重。

近年来，许多研究表明氢气可以改善多种疾病预后，但关于氢气治疗脑外伤的研究仍处于探索阶段，且内容多局限于低浓度（＜４％）氢气和氢水。报道显示，氢气的神经保护作用可能具有剂量依赖性，高浓度氢气具有更好的抗氧化应激、抗凋亡和抗炎症作用，且并未出现毒性作用。前期研究发现，低浓度氢气对脑外伤效果不明显，因此本次探索高浓度氢气对脑外伤预后的影响。本研究利用氢氧雾化机，以水为原料，采用水电分解法制备氢氧混合气。与以往报道的氢源相比，水电解法制备的氢源具有多方面的优势，它是从纯净的蒸馏水中提取的天然氢，而不是金属和酸的化学反应生成，所制备的气体浓度较高，且生产方便。在实验过程中，为保证高浓度氢气的安全性，大鼠在特定的防爆箱中吸入氢气，当气体逸出时，会很快被稀释到比爆炸极限浓度低得多的浓度，并通过特定的氢气浓度检测仪实时监测防爆箱周围的氢气浓度，确保整个实验过程的安全。综上所述，吸入高浓度氢气能够改善ＴＢＩ大鼠神经损伤，促进大鼠神经功能恢复，其相关机制可能与氢气抑制损伤区周围半暗带凋亡反应及氧化应激反应相关。