微生物也就是我们通常所说的菌种，是生物饲料生产中非常重要的因素。我们梳理了历届“中国生物饲料科技大会”中各位专家学者与此有关的论述，整理成今天这篇文章，以飨读者。历届大会专家云集，不少专家都对生物饲料中的菌种做了深入研究，这些研究涉及菌种的筛选、菌种的安全性评价、菌种的功能特点以及生物饲料中菌种的检测等方面。1. 菌种筛选
关于菌种的筛选，中科院天津工业生物技术研究所博士生导师，同时也是中科康源（唐山）生物技术有限公司董事长的张东远研究员专门提出：先进菌种开发是生物饲料开发的“王道”。并提出结合“组合诱变技术”和“高通量筛选技术”的筛选思路。组合诱变技术即通过一系列物理诱变、化学诱变、等离子体诱变以及它们的组合诱变，形成巨大的菌种突变体库。然后再结合高通量筛选技术从菌种的汪洋大海中筛选出目标菌种，比如产酶、产抗菌肽、产虾青素的高产菌种。关于高通量筛选，张东远博士特别介绍了微流控和流式细胞仪两种技术，微流控技术能形成相互分开、互不干扰的液滴微反应器，使单细胞分析和筛选细胞或其胞外分泌产物成为可能，再结合流式细胞仪的单细胞分析能力就能实现对单个细胞的筛选。对比传统微孔板筛选技术，该系统每小时能分析数十万菌株，降低试剂成本百万倍，具备速度快、通量高、成本低等显著特点，在菌种筛选中作用巨大。内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程教育部重点实验室”孙志宏博士介绍了实验室经过近20年的积累，构建了中国最大的乳酸菌菌种资源库。2001年至今，该实验室从中国、蒙古国、俄罗斯、哈萨克斯坦、巴拉圭等国家不同地区采集自然发酵乳制品、母乳、酸粥、泡菜、酸面团、米酒曲、鲊广椒以及人母乳和粪便、动物粪便等样品2,676份，从中分离乳酸菌8,520株，包括乳酸菌的8个属，146个种及亚种。但是菌株之间系统发育关系不明确和代谢多样性制约了乳酸菌的进一步开发利用，鉴于这些原因，该实验室应用二代测序技术完成了乳杆菌属213株模式菌株的基因组重测序。其中发现兼性异型乳杆菌位于祖先分支，逐渐分化为同型发酵、异型发酵乳杆菌；在这一过程中伴随有特征性糖代谢基因丢失和钝化的现象。如异型发酵菌株都不编码磷酸果糖激酶(pfk)和二磷酸醛缩酶(fda)。同时发现这些乳杆菌属的成员中细胞壁蛋白酶（CEP）有显著的进化特异性，比如赫赫有名的保加利亚乳杆菌家族成员多含有特定的结构。这些发现和系统发育研究对指导我们的菌种筛选方向有重要意义。
福建省农科院农业生物资源研究所研究员、微生物菌剂研发与利用国家地方联合工程研究中心主任刘波研究员关于生物饲料中菌种研究，则主要聚焦于生物饲料的先导菌种——芽孢杆菌，指出世界芽孢杆菌有10个科，136个属，1192个种；其中中国共有种类487种，占世界的40.8%；他的团队分离的“中国新纪录种”235个，占中国的48.2%，共保存了38,000株芽孢杆菌。针对芽孢杆菌的筛选，提出生物饲料菌种满足发酵的要求，应关注菌种的寡营养性研究，除了高产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等筛选，还需从适应高温、适应缺氮或缺碳生长等方面加以研究；满足益生的功能，则可以从对有害菌的抑制方面着手。中国农科院饲料研究所“中国-挪威鱼类消化道微生物联合实验室”周志刚研究员根据在水产领域关于生物饲料的研究，提出肠道黏附才是鱼类饲用乳杆菌抗感染的前提，而不是传统被认可的病原菌抑制，并举例说明了抑菌力小而粘附力强的菌种对罗非鱼、斑马鱼抗病力更强的情况。肠道黏附是一个需要更细化的概念，比如乳杆菌在斑马鱼肠道的黏附类型至少可以分为混合黏附、粘膜黏附、粘液黏附三种。根据鱼的浸浴攻毒免疫保护率试验结果表明，鱼类消化道混合黏附乳杆菌抗病力显著高于粘膜黏附或粘液黏附型，其中粘液黏附型乳杆菌停喂后会迅速流失诱发鱼类抗病力崩溃。综合以上问题，提出了水产领域生物饲料菌种筛选的特点，即鱼类消化道菌群存在巨大个体差异、种间差异与节律变化，并受制于多变的栖息生境及饵料来源，无论是菌群多样性、丰度还是稳定性均远不及哺乳类消化道微生态，而且传统益生菌并非鱼类消化道土著优势菌群。鱼类消化道菌群调控虽然可以摒弃传统益生菌的思路，改从鱼类消化道土著优势菌着手，但这些优势菌以厌氧的革兰氏阴性菌为主，产业开发及应用受到限制。鉴于此，我们一方面可以通过基因工程的方法将其有害效应元件去除；另一方面可以通过生物工程或生物化工的方法将传统益生菌和鱼类消化道土著菌（包括通常被视作潜在病原菌的种属）的益生元件放大加以应用。对于菌种的筛选，第三军医大学基础部实验动物学教研室主任魏泓教授介绍了一种特别的研究方法，即通过建立规模化无菌动物制备繁育体系，利用无菌动物来筛选菌种或菌群。无菌动物是菌株必不可少的研究工具，不管是在表型驱动、逐级筛选策略中筛选功能菌株，还是在阐明菌株之间相互关系以及菌株与宿主关系中都是必不可少的。2. 菌种安全性评估
除了菌种的筛选，生物饲料的菌种作为益生菌，其安全性一直是世界各国关注的焦点。欧盟目前执行的是QPS（qualified presumption of safety，QPS)）审批制度，QPS即“有资格认定是安全的”，是一种基于合理的证据和允许限制使用的假设。欧盟的这种审批制度可以提高安全性评价的连续性，由于减少了对具有悠久安全使用历史菌种进行不必要的、全面的安全审查，因此节省评估资源，而对个别菌种的某些方面存在怀疑时才进行安全性评估。但是关于悠久使用历史的标准难以判断，用来支持“安全使用历史”的数据最好是充足且可靠的，包括同行评议的科学出版物、政府文件、专家的科学意见等。目前欧盟的QPS目录中可以饲用的菌种大概有80余种，包括乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等。
美国目前没有单独可用的益生菌名单，执行的是一种GRAS（generally recognized as safe，GRAS）的审查机制。一种新益生菌的GRAS审查不是由食品药品监督管理局（FDA）来进行，而是由申请者负责。申请者自行组织专家，根据已有的科学文献和生产者的试验结果，评估所采用的生产流程、使用方式以及使用量下的安全性。如果评估结果符合GRAS要求，就向FDA备案。FDA不进行研究，只对申请材料是否可靠进行评估。如果没有不同意见，就认可申请者的结论， 如果认为材料不足以作出GRAS的结论，就以“证据不足”作为答复。我国对生物饲料菌种的管理，类似于欧盟，也是一种目录管理的方式。我国第一部生物饲料团体标准《生物饲料产品分类》中明确规定，生物饲料所用菌种必须是我国《饲料添加剂品种目录（2013）》中允许使用的菌种。根据我国的管理制度，该目录以外的菌种存在安全风险，都是禁止在生物饲料中使用的菌种。历届大会各专家学者对生物饲料菌种的安全性评价也都十分关注。中国农业科学院饲料研究所饲料加工创新团队李俊博士曾在大会中介绍了一个欧盟案例，即2015年8月欧盟食品和饲料快速预警系统（RASFF）通报了一起意大利产的用于猪饲料的谷氨酸渣中检出大量致病微生物蜡样芽孢杆菌以及其他细菌，分析可能是该批次产品生产菌种污染或灭菌不严格造成。在我国，蜡样芽孢杆菌不是生物饲料中允许使用的菌种，虽然某些国家某些蜡样芽孢杆菌菌株可以添加到饲料中使用，但产毒素的蜡样芽孢杆菌可以导致动物和人类中毒，在我国引发的食物中毒事件总量仅次于沙门氏菌。因此，这一事件也应引起我们的足够重视。内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程教育部重点实验室”主任张和平教授、中国农科院北京畜牧兽医研究所李明博士也都曾在大会报告中指出，即使所用菌种在《饲料添加剂品种目录（2013）》中，其有些安全性问题也应受到重视。李明博士介绍目前乳酸菌的安全性评价主要集中在两大方面，一是乳酸菌的抗药性基因，即在发酵过程和在宿主肠道中，抗药性基因转移的问题；二是乳酸菌的毒力基因，即关于影响宿主与组织关联性、影响宿主防御机制、分泌细胞裂解素等基因的评价。针对农业农村部规定新进入市场的益生菌需要明确到菌株，以及需要找到菌种的所有毒力基因和耐药基因等方面的要求，提出全基因组测序应作为益生菌安全性评价的首要方法。3. 菌种功能研究
历届生物饲料科技大会，很多专家也都对某些菌种的功能研究进行了汇报。中国农业大学动物营养学国家重点实验室张日俊教授、中国农业大学动物科技学院谯士彦教授、中国科学院微生物研究所钟瑾研究员、江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室邓禹教授都曾重点介绍了生物饲料中菌种抑菌物质的研究。
张日俊教授主要介绍了发酵饲料中高产细菌素及EPS乳酸菌的相关研究，指出细菌素是由细菌通过核糖体合成，具有杀菌或抑菌作用的肽类物质，其具有抑菌谱较窄、无毒、无残留、无抗药性等特点，可以作为天然防腐剂，也是抗生素替代品的优选方案。EPS也就是微生物的胞外多糖，具有免疫、抗氧化、抗癌、降胆固醇等功效。中国农大谯士彦教授则主要介绍了生物饲料菌种的抗菌肽研究，指出抗菌肽是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子，抗菌肽多途径的抗微生物感染机制使微生物不易对其产生耐药性。抗菌肽在调节和平衡微生物引起的炎症反应方面发挥重要作用，虽然一些核心的机制问题尚需进一步研究。抗菌肽在宿主细胞活化的多个步骤中也都有全面的能力，因此，抗菌肽不仅可控制微生物生长，还可修正炎症反应，重点介绍了枯草菌肽和肠杆菌肽方面的研究。中科院微生物所钟瑾老师也介绍了关于细菌素方面的研究，特别是重点介绍了羊毛硫细菌素的相关研究。羊毛硫细菌素是由细菌的核糖体合成，经翻译后修饰形成特殊氨基酸如羊毛硫氨酸lanthionine（Lan）、甲基羊毛硫氨酸methyllanthionine（MeLan）或脱氢氨基酸的一类具有一定抑菌活性的小肽，一般含有19-38个氨基酸，由革兰氏阳性菌产生，大多是乳酸菌或芽孢菌。钟老师详细介绍了羊毛硫细菌素的代表——nisin，nisin是Ⅰ类羊毛硫细菌素，也被称为乳链菌肽或乳酸链球菌素。此外，一些新型的细菌素suicin和cerecidin，以及新型非核糖体合成肽JM4-A和JM4-B的研究，为生物饲料菌种的功能研究开阔了思路。江南大学邓禹教授主要对生物饲料中乳酸菌益生作用的关键因子做了解析，研究乳酸菌中抑菌物质的系统和乳酸菌中糖苷酶。乳酸菌中的糖苷酶可以补充宿主在消化酶上的不足，帮助分解消化道中未被充分水解的营养物质，利于宿主进一步吸收利用，增加宿主必须维生素、氨基酸、微量元素等物质的获取，这对开发生物饲料中特定的益生菌、益生元产品以及精细化的菌酶协同发酵饲料产品具有重要指导意义。此外，中国工程院院士、江南大学食品学院陈卫教授就生物饲料中菌种对重金属危害的减除作用做了专门介绍。重金属中毒的传统治疗方法中要么副作用大，比如有很强的肾毒性，要么效果有限，而且没有针对性，比如补充维生素、果蔬等，而益生菌有可能是一种理想的应对策略。通过大量试验寻找适合的菌株，最终找到了一株既有强吸附能力，又有强耐受能力的植物乳杆菌，并以罗非鱼模型研究了其对镉暴露的保护作用，为我们开发减除重金属危害的生物饲料提供了思路。4. 菌种的检测
生物饲料中的菌种需要经过大量的筛选，需要经过安全性评价，也应该具有各种各样的功能，但是当其应用到生物饲料中时，经过了生物饲料生产的发酵过程，发酵过程往往是一个多菌种的生长代谢过程，有益菌得到生长，有害菌受到抑制或者杀灭，那如何精确检测这一过程和结果呢？内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程教育部重点实验室”主任张和平教授系统地介绍了一种方法可以实现这一目的，该方法首先是用PMA处理样品，PMA 常与 DNA 扩增技术相结合，并以细胞膜完整性作为活菌评价标准，实现对活菌的有效检测。样品添加 PMA 后，PMA 可被活菌完整的细胞膜阻止在外，但能渗入膜损伤细胞并插入双链 DNA 内。然后进行16S RNA全长扩增，再进行PacBio SMRT深度测序，就能把活菌与死菌分开进行鉴定。通过这一技术，发现发酵后的生物饲料菌群物种丰度指数和多样性指数均显著低于发酵前。这一结果表明添加益生乳酸菌发酵剂抑制了众多腐败菌和杂菌的生长，饲料中的微生物趋向单一化。这也为我们证明发酵饲料的生物安全性提供了有力的技术手段。结语
关于微生物的研究，特别是肠道微生物的研究，目前是世界各国的重点研究方向。我们生物饲料中的菌种研究也是方兴未艾，甚至可能才刚刚起步，还有很多的未解之谜有待我们共同开启，还有很多的特殊功能需要我们共同探索，生物饲料开发国家工程研究中心将不断丰富和完善中国生物饲料科技大会的形式和内涵，为更好的传播生物饲料科技不断努力！
图/文 编辑：菌酶博士
