|
作者：黄晶晶，肖盟，徐英春 单位：北京协和医院检验科 通信作者：徐英春 文章来源：协和医学杂志,2018,9(5):448-452. 随着感染性疾病防治在卫生保健方面的重要性日益凸显，感染性疾病引起的社会关注逐渐增多，新技术在人类预防和控制病原体传播方面发挥着巨大作用。 微生物实验室作为病原体检测的一线科室，通过镜检、培养、鉴定、药敏等方法，在感染控制中发挥着重要作用。传统分子诊断和基因分型方法提供的信息有限，通常不能满足疫情暴发和传播调查需求。 二代测序技术（NGS）在单次序列测定中可确定菌株基因组完整的DNA序列，并从这些数据中得到抗菌药物耐药性、毒力及分型等可用于疫情调查的信息，进一步用于开展疫情特异性筛查。 本文概述NGS技术在医院感染性疾病暴发调查、未知病原体鉴定、毒力分析、耐药基因组研究等临床微生物领域中的应用。 应用1—医院感染性疾病暴发的调查 NGS序列信息可报告感染性疾病暴发的传播链，并已被用于跟踪由鲍曼不动杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯杆菌引起的医院感染性疾病的传播。在医院感染性疾病暴发期间，当流行病学证据支持时，基因组序列可用于跟踪患者之间或环境来源的传播链。当流行病学联系缺失时，基因组序列也可帮助作出医院感染来源的假设，并且确定哪些病例与医院感染有关。当NGS数据在医院感染调查中整合时，可指导、回应干预措施，例如隔离病房或制定新的防控指南，以防止未来暴发。 使用基于WGS分型的优点是可促进流行病学研究和公共卫生调查，其在暴发检测和监测多药耐药病原体的演变和动力学中显得尤为重要。Wang等将2013年暴发于中国云南西双版纳的登革病毒进行WGS测序，经分析发现其属于DENV-3基因型Ⅱ，和老挝2013年分离株、孟加拉国2002年分离株基因型最为相似。Zhou等基于WGS描述了新出现的产CTX-M-15肺炎克雷伯菌序列型1427（ST1427）。此外，通过基因组系统发育分析，追踪在单中心治疗患者和随后转诊患者之间间歇性传播的产CTX-M-15肺炎克雷伯菌ST15。长期循环调查该区域患者群体以早期发现肺炎克雷伯菌高危克隆。 除了疫情追踪和表征外，WGS还有助于控制措施的实施以避免耐药病原体的扩散。荷兰曾发生机构间传播的碳青霉烯酶耐药肺炎克雷伯菌的暴发流行，卫生部门通过将所有检测阳性的居民隔离至医疗机构外单独治疗以避免更多人感染。 应用2— 未知病原体的鉴定 快速鉴定新发突发感染性疾病病原体，在最短时间内准确获取病原体的全面信息，对于能否有效控制感染性疾病疫情具有决定性意义。病毒性病原体的检测主要包括病毒抗原检测、核酸检测以及病毒分离培养等。病毒分离培养及抗原检测因方法学的固有缺陷，无法满足临床快速、准确鉴定新发突发病毒性病原体的需求。虽然临床微生物实验室可采用特异性强、敏感性高的荧光定量PCR对疑似病毒进行筛查和确认，但其必须建立在已知病原体基因序列基础上，无法对未知病毒病原体进行检测。 沙特阿拉伯Saeb等在传统鉴定方法失败后，通过NGS技术结合生物信息学、系统发育和病原学分析报道了首例人感染溶血梭菌（Clostridium haemolyticum）。研究发现，该菌株是一种潜在的致病菌，具有抗生素耐药性，且对人类宿主及其周围环境耐受力强，除质粒的新型重组外，染色体中存在毒力因子，可能是人类感染发生的原因。这项工作表明NGS用于临床微生物病原体鉴定，特别是对更多微生物样本进行NGS序列分析并在公共数据库中共享的重要性。 应用3—毒力分析 了解病原体毒力概况对于预测疾病严重程度和转归，以及在疾病早期进行风险评估至关重要。WGS有可能通过使用在线工具来确定毒力因子的存在，不仅限于特定基因。 WGS可用于表征高毒力细菌，如产志贺毒素的大肠埃希菌（STEC）O104：H4型。STEC曾引发过大规模疫情，然而其已知的进化历史和基因组多样性信息较少。使用WGS进行暴发和非暴发菌株系统发育学分析，为其后续研究提供了进化背景，并揭示谱系特异性标记，指示了选择性压力和适应性选择。此外，产志贺毒素的肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）Stx2a O104：H4的核心基因组系统发育分析显示，不同聚类、不同耐药性、毒力模式取决于隔离时间。 在大型队列研究中，WGS可用于描述STEC的分子特征。所有关联菌株的基因型、血清型、MLST、毒力、抗菌药物耐药谱和系统遗传背景等信息均可从序列数据中获取，以获得全面、高分辨率的分子特征。NGS可在相对较短时间内详细描述和比较多种菌株。因此，WGS在改进病原体分子流行病学监测中的作用不可否认。 应用4—耐药基因组研究 除了鉴定病原体之外，还可使用宏基因组学方法来研究耐药基因组。肠道细菌是抗菌药物耐药基因（ARG）的已知储存库，抗菌药物治疗对肠道细菌耐药基因组产生影响，可导致水平基因转移和耐药菌的选择。一项蒂宾根大学的研究调查了2例经环丙沙星治疗6 d的患者，通过宏基因组学分析显示肠内存在ARG，并提出分析抗菌药物选择压力的新方法，可用于医院比较治疗方案及评估其对肠道细菌耐药基因组的影响；临床医生需格外关注抗菌药物的选择，优先使用对患者肠道菌群选择性压力较小的抗菌药物，可能减少耐药菌株的传播。 NGS数据库中已有报道，在生命垂危和住院患者体内发现了质粒黏菌素耐药基因mcr-1。欧洲国家通过回顾性研究对NGS数据库中的mcr-1基因进行调查，从而引发丹麦、德国和荷兰的病例检测。在荷兰，2000多例当地患者肠杆菌科菌株在数小时内被筛选，以揭示mcr-1基因的存在。因此，已经存在的NGS数据可用于筛选新的抗菌药物耐药基因。 总结 NGS技术的发展使得人类更深入地了解微生物的变迁和进化，更全面、准确地描述菌株基因型、毒力、抗菌药物耐药谱和系统遗传背景等信息，通过使用独特的标志物进行疫情追踪，为医院感染性疾病的暴发调查奠定理论基础。此外，NGS在临床微生物实验室中可标准化病原体的分型方法，用于分子诊断、感染预防、病原体鉴定和监测以及新型抗菌药物耐药基因检测。然而，随着NGS在医学中的广泛应用，其技术流程和数据分析对临床微生物实验室提出了更高要求。研究者不仅需处理比传统基因分型更多的数据量，还要结合应用生物信息学和流行病学等内容。此外，从国内外研究来看，建立一个全球范围内共享的NGS数据库非常有必要，其将有助于突发、新发感染性疾病的及时诊断，并有助于开发微生物基因组学应用于感染性疾病监测和疫情调查的全部潜力。 然而，NGS工作流程的改善，特别是缩短文库制备时间和数据分析自动化等方面尚需进一步探索。此外，建立统一的病原体分型标准，从而构建全球共享的NGS参考数据库以进一步降低成本势在必行。唯有如此，感染性病原体的监测与管理，以及基于NGS数据的靶向抗生素治疗才能实现，从而推动个性化微生物学的发展。 志谢： 感谢中国医学科学院阜外医院周洲教授在NGS数据解读方面给予的指导；感谢北京协和医院检验科张栋在文章撰写方面给予的帮助。  参考文献略 第一作者简介 黄晶晶 北京协和医院检验科，在读博士研究生，现任华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST）IT部秘书。 通信作者简介 徐英春 研究员、教授、博士研究生导师，北京协和医院检验科主任，临床生物标本管理中心主任，临床检验诊断学系主任。 主要学术兼职： 欧洲临床抗菌药物敏感实验委员会（EUCAST）华人抗菌药物敏感实验（ChiCAS）分委会主任委员，欧洲临床微生物感染疾病学会（ESCMID）合作实验室主任，世界华人检验舆病理医师协会副会长，国家卫生计生委抗菌药物临床应用与细菌耐药评价专家委员委员兼办公室主任，国家卫计委合理用药专家委员会抗菌药物组副组长，国家卫计委全国细菌耐药监测网质量管理中心负责人，中国医师协会检验医师分会常委。   协和医学杂志 公众号：xieheyixue |
|
|
