|
大小鼠注意缺陷冲动障碍模型（ADHD)的行为学检测方法 一.前言 注意缺陷/多动障碍(attention-deficit/hyperactivity disorder, ADHD)是最常见的儿童时期神经和精神发育障碍疾病，在全球范围内学龄儿童的患病率约为5%，其核心特征是多动、冲动或注意力缺陷。然而ADHD的病因尚无定论。患儿在平时生活、学习过程中表现为容易分心、注意力难以集中、多动、冲动行为增加并伴有学习困难、神经系统异常、脑电图异常等表现。随着年龄的增长，部分ADHD患儿症状可自行缓解。但ADHD患儿中约40%-60%的儿童症状能持续到青春期，约30%一40%患儿会延续到成年期。患儿发病后症状延续到青春期和成年期时，除了存在核心症状外，还可能存在物质滥用、人际交往不良、社会适应能力差等表现。ADHD显现出的“两高一低”特征:即高发病率、高犯罪率和低寿命，已经给家庭、学校和社会造成极大的伤害和沉重的负担，是亟待解决的儿童心理精神卫生难题。
二.ADHD动物模型的研究现状 1.自发性高血压大鼠（SHR） 自发性高血压大鼠(SHR)是通过选择性近亲繁殖构建的用于高血压研究的动物模型。许多研究证实SHR是用于研究ADHD较好的动物模型之一。 SHR大鼠表现出几种主要的ADHD症状，如多动、冲动、学习障碍。这些发现表明该模型具有较好的表面效度。然而，高血压在这种动物模型中是一个混杂因素，因为它与ADHD无关，不能排除血压升高会影响行为。SHR大鼠表现出的ADHD样行为缺陷可能反映了高血压引起的脑功能障碍或损伤。因为有研究表明高血压对人的认知有负面影响。总而言之，SHR是一个被广泛研究的ADHD模型，许多研究已经确认了其有效性，然而高血压造成的影响和使用WKY大鼠作为其对照动物的可靠性仍然是一个有待解决的问题。 2.发育毒素动物模型 新生期6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤大鼠也被认为是一种有用的ADHD模型。6-OHDA是一种神经毒素，可被DAT和NE转运体摄取，从而选择性地杀死这两种类型的神经元。出生后第1天用6-OHDA损伤的大鼠在发育特定阶段表现出多动和学习障碍。它们在经过呱醋甲酷或d-安非他明治疗后得到改善的空间辨别任务中表现出多动和学习障碍，但它们并不表现出冲动。 3.甲状腺素受体转基因小鼠 一种相对较新的ADHD动物模型是甲状腺素受体转基因小鼠。该基因来源于一名被诊断为甲状腺激素抵抗综合征的患者。这种罕见的综合征是可遗传的，其特征是甲状腺激素水平升高、促甲状腺激素(TSH)正常或升高、身材矮小、听力丧失和心动过速。有趣的是，大约70%患有RTH综合症的儿童符合ADHD的诊断标准。这表明这两种疾病中存在与甲状腺系统有关的共同机制。 三.注意缺陷/多动障碍动物模型的行为学检测方法 1.旷场实验 旷场实验的实验装置主要由两部分组成，一部分是小鼠用旷场反应箱体，另一部分是数据自动采集和分析系统(上海欣软信息科技有限公司VisuTrack动物行为学分析系统)。旷场反应箱体为亚克力材质，其中箱体四壁为一体，旷场底面有四道卡槽，使得箱体四壁可拆卸下来方便清洗。箱体内壁四面涂黑，旷场的底面为白色磨砂亚克力材质。旷场尺寸为长40 cmX宽40 cmX高45 cm，中央区设定为距离侧壁10 cm。数码摄像头放置于旷场的正上方，可实时拍摄旷场内部情况，摄像头与VisuTrack数据采集和分析系统相连。小鼠行为学实验室背景噪音控制在65分贝以下。小鼠在行为学实验室适应1h后，轻轻将小鼠放入旷场实验箱侧壁中间位置，同时开始进行摄像和计时。30 min后停止摄像，记录小鼠在30 min内总的运动距离和运动速度以及小鼠在实验前5 min内中央区停留时间。实验结束后，将小鼠放回鼠笼，反应箱用30%酒精擦拭。所有的旷场实验在18:00-20:00进行。  2.步态实验 采用上海欣软VisuGait小动物步态分析系统对小鼠进行步态分析。即经过10分钟的适应阶段后，系统自动记录并测量小鼠每一步的长度和宽度，以供之后的步态分析。 3.肌力实验 攀爬网是由直径为1 mm钢丝构成的边长40 cm正方形的钢丝网。钢丝网分成40X40的边长1 cm正方形。钢丝网周围环绕着直径为4cm的木质珠子(以防止小鼠偶尔会试图爬到钢丝网的另一面)。使钢丝网保持在一个固定的位置上，高度距衬垫表面50厘米。实验时将小鼠在测试前1小时转移到行为室以适应环境。实验开始时，每只小鼠被放置在钢丝网的中心，之后慢慢地旋转钢丝网180度至倒转的位置，并开始计时，直至小鼠坠落到衬垫上时停止计时。我们记录每只小鼠在钢丝网上倒挂的总时间，或者在当小鼠在钢丝网上倒挂至420秒时，人为的将小鼠取下钢丝网。 4.五孔视觉注意力测试实验 采用上海欣软信息科技有限公司五孔视觉注意力测试箱， 5-CSRTT训练箱中有5个内含红外探头和指示灯的圆孔洞(鼻触，nosepoke)安装在一个弧形的面板上，每个鼻触内有一个信号灯，随机快速闪亮一个，动物必须在给定时间内用鼻子进入该鼻触才可以得到食物奖赏(颗粒或液体食物)。测试的实验指标:Total Trial(总的实验)，Correct Response(正确反应)，Incorrect Response(错误反应)，Omitted Responses(遗漏反应)，Premature Response(过早反应)。其中正确反应次数反映小鼠的注意力水平;过早反应次数反映小鼠的冲动行为水平。实验中，小鼠有时根本没有注意到鼻触孔亮灯的视觉刺激，因此不触碰5个鼻触孔中的任意一个，而不是触碰“猜测”亮灯的鼻触孔，从而出现一个遗漏反应而非错误反应。因此，遗漏反应的增加，通常伴随着正确反应总数的减少，也可以反映注意力的不足。 为增强小鼠对食物奖赏的反应，所有小鼠在实验开始前按照每天每l0g体重给予1g食物的方法进行限食。当小鼠的体重达到初始体重的85%-90%时，开始进行5-CSRTT实验的6阶段训练。小鼠在5-CSRTT实验箱中训练，在正确鼻触反应和奖励(15%蔗糖溶液)之间建立条件反射，6个阶段的训练对小鼠注意力水平要求逐渐增加，只有当小鼠连续2天达到某一阶段训练的正确次数要求后，才能进入下一阶段的训练过程。全部6阶段的训练过程大概持续1个月(见附表)，训练完成后进行正式实验。每阶段训练和正式实验结束后，按照下列公式计算:正确反应率=正确反应次数/(正确反应次数+错误反应次数+冲动反应次数+无反应次数);错误反应率=错误反应次数/(正确反应次数+错误反应次数+冲动反应次数+无反应次数);冲动反应率=冲动反应次数/(正确反应次数+错误反应次数+冲动反应次数+无反应次数);无反应率=无反应次数/(正确反应次数+错误反应次数+冲动反应次数+无反应次数)。
5.新事物识别实验 新事物识别实验(Novel object recognition test)是一种常用于评估小鼠学习记忆能的行为学实验范式。通常情况下，小鼠会表现为花费更多时间探索新遇到的物体，而非以往遇到过的物体。因此常采用小鼠对新旧物体探索时间的比值作为测量指标，反映其学习记忆能力。本实验以旷场行为学箱体为基础，通过测量不同时间点小鼠对箱体内不同形状的物块的探索时间，从而检测小鼠的长短期记忆情况。箱体规格同前，实验时间为20:00到22:00。使用上海欣软信息科技有些公司VisuTrack行为学分析系统记录并分析小鼠对旷场中物块的探索情况。具体步骤如下: 第一步:适应。在新物体识别箱的底面放置两个形状完全相同的物块，其中心与箱子相邻两壁的距离均为10 cm，之后将小鼠背对物块放入新物体识别箱中，使其自由探索10 min。 第二步:短期认知记忆测试。适应结束后1h再次对小鼠进行测试，用一个形状不同但材质相同的物块替换掉两相同物块中的一个，测试时间5 min(短期认知记忆)。 第三天:长期认知记忆测试。第二步结束后24h再次对小鼠进行测试，用第三种形状的物块替换掉第二天测试阶段使用的新物块，时间5min(长期认知记忆)。 注意事项:①实验在20:00到22: 00进行，需保持实验环境的安静，并且保持实验箱内光照强度的稳定;②在本实验中，新物体识别箱的底面和四壁以及使用的物块应当在每一只小鼠测试进行前后使用30%的酒精擦拭干净并晾干后，再行下一步操作;③当出现小鼠在新物体识别箱中持续蜷缩保持不动或对物块完全不进行探索的情况时，可能是对陌生环境的恐惧或酒精擦拭不彻底、残留的同类气味刺激所引起的，统计数据时应当排除。 |
|
|
