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Cancer Res 2020 Feb 1 IF:12.705 INTRODUCTION VEGF及其受体(VEGFR)已被确定为血管生成的关键介质。VEGF与三种不同的酪氨酸激酶(TK)受体(VEGFR1-3)的相互作用在生理和病理血管生成中发挥重要作用，包括肿瘤血管生成。因此，抑制这一途径被认为是一种有希望的治疗高血管化癌症的方式。 尽管一些使用贝伐单抗（这是一种针对VEGF的药）的临床报告，都显示了针对VEGF可以延长无复发生存期(RFS)，但它未能改善新诊断GBM患者的总体生存结局。 我们认为某些关键的抑制通路可能被激活，从而危害由VEGF抑制介导的抗肿瘤反应。 以往的研究结果表明，VEGF阻断可导致治疗肿瘤内血管重构、灌注减少和缺氧增加。也观察到肿瘤细胞侵入正常大脑的显著增加。对VEGF阻断治疗的潜在机制已经进行了大量的研究，但仍存在许多问题。 我们对人类胶质瘤的研究表明，胶质瘤血管生成与瘤内CD4þ和Foxp3þ T细胞之间的联系影响了胶质瘤患者的肿瘤进展。激活的CD4þ T细胞在贝伐单抗耐药复发肿瘤中显著升高。调节性T细胞(Treg)被确定为该患者群体进展的独立危险因素。因此，我们假设抑制VEGF/VEGFR通路可能会对抗肿瘤免疫产生负面影响，从而导致治疗失败。 在本研究中，我们使用两种VEGF阻断剂(抗vegfa或抗vegfr2)在胶质瘤模型中验证了我们的假设。我们发现VEGF抑制通过调节谷氨酸/胱氨酸逆向转运体增强了Treg的抑制功能，联合使用Treg阻断剂可以克服这一效应。 RESULTS 1.VEGF阻断改变肿瘤免疫环境 为了深入了解VEGF阻断对神经胶质瘤免疫景观的影响，我们用不同数量的抗VEGFA抗体治疗患有恶性神经胶质瘤的C57BL/6小鼠，直到治疗终点(图1A)。 后续，我们利用RNA-seq分析获得的数据，评估VEGF治疗富集的主要通路。反应体通路富集首先被用于评估抗vegf治疗后的整体遗传景观变化。结果表明，前20条富集通路中有5条与免疫相关(图1B)。 这些结果表明，VEGF的阻断可能改变GBM的免疫格局。为了验证我们关于抗vegf治疗改变免疫基础结构的假设，我们使用了一个750个免疫相关基因集，该数据由来自24种不同免疫细胞类型、检查点、CT抗原和跨越适应性和先天免疫反应网络的基因的770个基因(750个免疫基因和20个内参基因)组成。在使用2D PCA的抗vegfa治疗中观察到剂量依赖的分离/聚类，而正常大脑与抗VEGFA治疗的样本明显分开(图1C)。 我们没有从中发现单独使用VEGF阻断治疗后M1:M2比值的变化。然而，我们确实注意到，在抗VEGFA治疗后，TREG和耗尽的CD8 t细胞基因得分呈剂量依赖性增加(图1D和E)。  图1 2.抗VEGF治疗后，脾脏和肿瘤中Treg的富集 我们用另一种VEGF阻断剂—抗VEGFR2。分别连续给药抗VEGFR2后，对D10、D17和D25采集肿瘤(图2A)。 在D17日，发现肿瘤大小与未治疗(NT)组相当。然后对TILs进行流式细胞术分析，如图2B所示。 在肿瘤植入后的第17天，VEGFR2处理的小鼠脾脏中Treg的百分比大约是对照组的1.7倍，但在相同治疗计划和剂量的健康小鼠脾脏中没有看到类似的变化。(图2C） 在肿瘤中，Treg分数在D17时下降了约25%，但在D25时下降了近三倍，达到35.5%(图2D)。 抗VEGF治疗组小鼠的生存时间延长，肿瘤浸润性Treg在较晚时间内显著增加，可能是累积效应的结果。为了验证这个问题，我们加入了一个对照组(抗PD-L1)，该组提供了与抗VEGFR2治疗相似的生存期(图2E)。 在D25，抗VEGFR2治疗的肿瘤与同一时间取样的抗PD-L1治疗的肿瘤相比，Treg频率、Treg /CD8þ t细胞比率和Treg /Tconv比率均显著升高。在NT组(D17，终点)和抗PD-L1组(D25)之间没有观察到这些参数的显著增加(图2F)。  图2 3.VEGF治疗前使用抗CD25抗体阻断Treg可恢复抗VEGFR2治疗介导的抗肿瘤活性 为了确认treg是否是限制VEGF阻断疗效的主要因素，我们试图在抗VEGFR2治疗前通过CD25靶向抑制消除Treg。在第10天和第12天给予两剂抗CD25抗体，然后每3天给予抗VEGFR2治疗，直到治疗终点(图3A) 使用抗VEGFR2和抗CD25抗体作为单一疗法(与未治疗的动物相比)，动物的生存期有中度改善。联合组的改善更为显著(图3B)。 然后我们评估了CD4þ T细胞上的CD25表达，发现抗CD25抗体在D25消除了TILs上的CD25表达，尽管如此，这些结果仍表明在体内阻断CD25对CD4þ T细胞的有效控制作用(CD8þCD25þ T细胞未被检测到)(图3C) 综上所述，Treg在抑制抗VEGF治疗的抗肿瘤作用中发挥着关键作用，可以通过靶向抑制Treg来克服这一问题。  图3 4.抗VEGF治疗后SLC7A11基因表达的升高与肿瘤内Treg的增加相关 在寻找三剂抗VEGFA治疗肿瘤中重叠基因表达增加的过程中，我们发现了三个基因，对其增长有作用。 使用qPCR，我们证实了SLC7A11和cct结合伙伴CD98 (SLC3A2)的基因表达在抗vegfr2治疗后增加(图4C和D)。xCT蛋白在治疗后的肿瘤比未治疗的肿瘤表达更高(图4E)。 因为我们观察到抗VEGF治疗会导致更缺氧的肿瘤微环境，我们评估了缺氧相关基因HIF1a的表达。观察到HIF1a基因表达量呈剂量依赖性增加(图4F)。  图4 5.谷氨酸促进体外Treg功能 先前的研究表明，谷氨酸通过多种机制在胶质瘤的恶性进展中发挥了中心作用。我们在本研究中发现，抗VEGF可以增强谷氨酸/胱氨酸逆向转运蛋白的表达，从而导致肿瘤产生更多的谷氨酸。因此，我们在体外进行了l-谷氨酸存在下的Treg抑制实验。结果显示Tconv细胞增殖受到剂量依赖的抑制(图5A-C)。 通过检测CD69在人群中的表达，观察到Tconv细胞的激活显著降低(图5D)。 同时，Treg表型分析显示，添加谷氨酸后，早期和晚期t细胞活化标志物CD69、CD154和Ki67的表面表达量呈剂量依赖性增加(图5E-G)。 在仅含Treg或Tconvv的培养细胞中添加谷氨酸后，Treg细胞总数增加，而Tconv细胞中未见变化(图5H和I)。  图5  图6 CONCLUSION 抗VEGF治疗延长了胶质母细胞瘤患者的无复发生存期，但不能提高总生存期。为了解决这一差异，我们在胶质瘤模型中研究了抗VEGF治疗的免疫抵抗机制。一项抗VEGF治疗后肿瘤中免疫相关改变的筛选发现了剂量依赖性的调节性t细胞(Treg)特征基因的上调。荷瘤小鼠脾脏中Treg数量增加，抗VEGF治疗后肿瘤中treg数量增加。在抗VEGF治疗前用CD25阻断消除Treg恢复了CD8þ T细胞IFNg的产生，并改善了抗VEGF治疗的抗肿瘤反应。 治疗后的肿瘤过表达谷氨酸/胱氨酸反向转运蛋白SLC7A11/ xCT，导致肿瘤细胞外谷氨酸升高。谷氨酸促进Treg的增殖、激活、抑制功能和代谢型谷氨酸受体1 (mGlutR1)的表达。我们提出，VEGF阻断结合胶质瘤来源的谷氨酸，通过促进Treg的过度表达和功能，诱导系统和肿瘤内的免疫抑制，这可以通过减少Treg来增强抗肿瘤作用。 Dysregulation of Glutamate Transport Enhances Treg Function That Promotes VEGF Blockade Resistance in Glioblastoma PMID: 31723000 DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-19-1577 |
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