【原】【LorMe周刊】利用细胞内甘油三酯提高链霉菌聚酮化合物滴度

作者：姚感，南京农业大学博士在读。主要研究链霉菌代谢产物对植物根系微环境的影响。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍链霉菌聚酮合成至关重要的代谢流量调控机制，原文于2020年发表在《Nature Biotechnology》上。

导读

阿维菌素等具有重要药理作用的聚酮类化合物，大多是在发酵罐中处于稳定期的链霉菌产生的次级代谢产物。通常聚酮类化合物生物合成的代谢物来源是难以预测的，研究应用多组学揭示了初级代谢中积累的细胞内甘油三酯(TAGs)在稳定期被降解，并证明此过程可以将来自细胞内TAG和细胞外底物的碳通量引导到聚酮化合物的生物合成中。随后研究设计了 “TAG动态降解（ddTAG）”的策略来调动TAG池并增加聚酮化合物的生物合成。借助ddTAG策略，研究增加了天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌和阿维链霉菌等链霉菌中聚酮类次级代谢产物滴度。

主要结果

细胞TAG用作稳定期中的碳源。首先，研究对天蓝色链霉菌菌株M145（可以产生聚酮化合物Actinorhodin，Act）和HY01（M145的高产Act突变菌株）在96小时的时间过程中进行了比较代谢组学分析（图1b）。发现糖酵解（EMP）、磷酸戊糖途径（PPP）、三羧酸循环（TCA）和氨基酸代谢（AAM）等主要代谢途径相关的代谢物，在指数阶段（12-36小时）积累，然后下降到低水平（36-72小时）并在整个稳定期（72-96小时）保持相对恒定（图1d）。但脂质代谢途径中的代谢物模式与EMP、PPP、TCA和AAM途径中的代谢物模式之间存在差异。脂质代谢途径代谢物，包括游离脂肪酸（FFA）和单酰基甘油（MAG），在48小时左右达到最大积累，然后持续下降（图1d）。作者推断，分解代谢为FFA和MAG的TAG池可能代表我们提出的用于聚酮化合物生物合成的一组关键细胞内代谢物。

图1 鉴定与聚酮化合物产生相关的细胞内代谢物。a，初级代谢和聚酮化合物生物合成之间转换的示意图。b，在SMM培养基中葡萄糖消耗、细胞生长和Act产生。c，通过GC-MS收集的已识别代谢物的分类。d，M145中不同代谢途径的趋势。e，TLC对PL和TAG的时间分布。f，在48h采样的M145中TAG的不同脂肪酸部分的比例。

细胞TAG池有助于提高产量。与M145相比，高产菌株HY01产生更多的Act，但消耗的葡萄糖更少（图1b），同时在稳定期晚期，HY01中更多的胞内TAG被降解（图2a），TAG降解产物3-磷酸甘油、3-磷酸甘油酸和磷酸二羟丙酮的也更高。因此，细胞TAG池的降解可能是高产菌株HY01比M145产生更多Act同时消耗更少葡萄糖的原因。为了评估细胞TAG池对Act生产的贡献，研究对两株菌代谢组数据进行了比较分析。结果表明，随着时间的推移，TAG池越来越促进Act的产生。不同菌株之间TAG池对Act产生的不同贡献水平在稳定期后期变得最明显（图2b），相比之下，其他代谢物（如氨基酸）对Act产生的贡献减少。

产生聚酮化合物的链霉菌中的TAG池。研究分析了M145中细胞TAG的浓度、葡萄糖消耗和Act产生。TAG池在初级代谢过程中积累并在Act生物合成过程中降解（图2c）。研究评估了所有794种细胞内代谢物与葡萄糖摄取之间的关系，以及整个时间过程中聚酮化合物的产生。发现14种TAG脂肪酸部分的积累模式与初级代谢中的葡萄糖使用呈负相关（20-48小时）（图2d），并且降解来自TAG池的几乎所有脂肪酸部分的模式始终与M145中晚期稳定期（72-96小时）的Act积累模式呈最负相关。通过在相同培养条件下分析M145的实时转录组发现，脂肪酸生物合成基因的转录物在初级代谢中上调，在Act生产中下调，而编码β-氧化酶的基因转录在Act生产中上调（图2e、f）。研究还分析了先前发表的在不同培养基和培养条件下生长的天蓝色链霉菌的转录组数据，并发现了类似的趋势。最后，作者还对三种生产不同聚酮类次级代谢产物的工业菌株进行研究，也得出TAG池在生长过程中积累，然后在产生聚酮化合物的稳定期降解。

图2 细胞TAG池有助于稳定期的Act产量。a，M145和HY01消耗TAG池比较。b，M145和HY01在稳定期后期发生显着变化的前20种代谢物。c，葡萄糖消耗曲线（黑）、TAG代谢曲线（橙）和Act产生曲线（蓝）。d，寻找与葡萄糖消耗（上）和Act生物合成（下）负相关的代谢物。细胞TAG池的脂肪酸部分用橙色条表示。e，f，参与脂肪酸生物合成（e）和β-氧化途径（f）的基因的转录谱。蓝色曲线表示所选基因的整体转录趋势。  

    

TAG分解期间的代谢通量。为了更好地了解HY01中TAG池的分解，研究在培养基中加入[U-13C]标记的油酸盐，培养24小时后，HY01中标记和未标记的Act比M145中高（图3a）。还测试了来自葡萄糖的碳通量是否有助于稳定期的Act生物合成。在加入[U-13C]标记葡萄糖72小时后， HY01和M145中标记的乙酰辅酶A的量几乎相同，表明M145和HY01之间的糖酵解途径缺乏显着差异。尽管标记葡萄糖的摄入量和标记乙酰辅酶A的细胞水平几乎相同，但我们在HY01中观察到更多标记的Act（图3b），这表明HY01中的TAG降解使更多的碳从葡萄糖中被输送到Act的产生中。数据显示，β-氧化降解的TAG在HY01中产生更多的还原当量和ATP（图3c-e）。因此，我们在添加或不添加外源NADH和/或ATP的情况下测量了天蓝色链球菌细胞提取物中KGDH、IDH和CS的活性。我们发现所有三种酶都被单独添加NADH或ATP抑制，并且当添加NADH和ATP时观察到最大程度的抑制（图3f-h）。这一发现支持了细胞TAG池的动员削弱了向TCA循环的碳通量的结论。

图3 TAG库的高产机制。a，使用[U-13C]油酸盐追踪从TAG降解到Act生物合成的碳通量。b，通过补充[U-13C]葡萄糖来追踪从葡萄糖到Act生物合成的碳通量。c-e，M145和HY01在静止期的NADH/NAD+(c)ATP/ADP(d)和NADPH/NADP+(e)的比较。f-h，NADH和/或ATP对KGDH(f)、IDH(g)和CS(h)活性的影响。i，乙酰辅酶A(AcCoA)节点的质量平衡。

参与细胞TAG动员的基因。脂肪酰基辅酶A合成酶（ACS）是脂质分解代谢的必需酶，通过与辅酶A（CoA）的硫酯化激活脂肪酸进入β-氧化循环（图4a）。负责β-氧化的基因的转录物在稳定期都被上调（图2f），而ACS同源物的转录物谱是不规则的，这表明脂肪酰基-CoA合成更可能是链霉菌中TAG降解的控制点。研究对125个链霉菌的888个ACS进行序列同一性分析，发现了五组在链霉菌中保守的ACS（图4b），并实时定量PCR分析了这五组ACS基因转录。与M145相比，HY01中sco6196的表达显着更高（图4c）。此外，在稳定期HY01中sco6196转录产物的数量增加（图4d）。因此，我们假设sco6196可能是导致TAG池退化的原因。

为了进一步分析sco6196的作用，研究构建了一个sco6196缺失的M145菌株（6196DM）和一个sco6196过表达的M145菌株（6196OE）。与M145相比，6196DM产生的Act显着减少（图4e），并且在稳定期后期含有更多的细胞TAG池（图4f）。6196OE具有相反的表型（图4e，f）。我们进一步分析了细胞TAG池的脂肪酸部分，并表明sco6196的缺失阻止了具有广泛脂肪酸部分的细胞TAG的降解（图4g）。

图4 鉴定负责细胞TAG动员的Sco6196。a，从细胞TAG池到聚酮化合物的代谢途径的。b，125个链霉菌基因组中888个ACS的成对序列同一性分析。c，M145中五种保守ACS在72小时的相对转录水平。d，M145和HY01中sco6196转录物的时间分布。e，SCO6196对Act产生的影响。f，TLC在96小时检测M145、6196DM和6196OE中剩余的细胞TAG池。g，来自M145、6196DM和6196OE的剩余细胞TAG库的脂肪酸部分的水平。

用于聚酮化合物滴度提高的ddTAG策略及应用。最后，研究将sco6196基因置于cumate诱导型启动子的控制下构建了ddTAG模块，以选择性控制TAG降解的时间和强度（图5a）。我们将ddTAG质粒转化为M145以产生菌株M145-DT，并发现使用诱导剂调节TAG降解可以增加Act滴度（图5b）。在最佳条件下，M145-DT的Act滴度比M145和HY01分别高190%和58%。

为了测试ddTAG策略是否使工程菌株能够通过在固定期补充碳源来保持更高的生产力，在确定的诱导条件下在M145和M145-DT中在72小时补充葡萄糖（图5c）。在相同进料条件下，M145-DT的比生产率比M145提高了50.1%（图5d）。该结果表明，ddTAG策略选择性控制TAG降解可有效提高补料分批发酵中的聚酮化合物滴度。

最后，为了研究ddTAG策略在其他产生聚酮化合物的链霉菌中的适用性，研究将ddTAG策略应用于委内瑞拉链霉菌ISP5230，提高其jadomycin B产量1.7倍（图5e）；将其应用于龟裂链霉菌M4018，提高其土霉素产量从6.24增加到9.17g l-1（图5f）；将其应用于阿维链霉菌A56中，其在摇瓶中和发酵罐中阿维菌素B1产量分别提高95.26%和50%（图5g）。

图5 用于聚酮化合物滴度提高的ddTAG策略。a，TAG动员的时间控制。b，确定在M145-DT中产生Act的最佳条件。颜色条表示Act的滴度。c，补充条件下ddTAG策略的性能。d，ddTAG策略对有(+)或没有(-)葡萄糖进料的发酵中比生产率的影响。e，使用ddTAG策略的JadomycinB滴度提高。f，使用ddTAG策略的土霉素(Otc)滴度提高。g，在发酵罐中使用ddTAG提高阿维菌素B1滴度。箭头表示添加诱导剂的时间点。

结论

链霉菌物种能够在生长过程中积累TAG。在稳定期对TAG动员的合理控制增加了乙酰辅酶A，还原当量和ATP。高水平的还原当量和ATP抑制了TCA循环中关键酶的活性，使乙酰辅酶A到TCA循环的碳通量减弱，向聚酮化合物产生的碳通量增强。随后研究设计了一种ddTAG策略来微调TAG动员的时间和程度，从而提高聚酮化合物的滴度。该策略使Act、jadomycin B、土霉素和阿维菌素B1在天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌、龟裂链霉菌和阿维链霉菌中的效价分别显着提高，表明该策略具有广泛的适用性。在摇瓶和工业生物反应器中的一致结果证明了ddTAG方法在商业应用中的巨大潜力，同时，ddTAG可以与现有工业工程菌株相结合，以进一步提高滴度（图5f，g）。研究使我们能够更好地了解细胞TAG代谢，并为提高链霉菌中聚酮化合物的滴度提供了一个简单的工具。

论文信息

原名：Harnessing the intracellular triacylglycerolsfor titer improvement of polyketides in Streptomyces

译名：利用细胞内甘油三酯提高链霉菌聚酮化合物滴度

期刊：Nature Biotechnology

DOI：10.1038/s41587-019-0389-3

发表时间：2020

通讯作者：Weishan Wang

通讯作者单位：中国科学院微生物研究所