|
文章信息 题目：Building customizable auto-luminescent luciferase-based reporters in plants 刊名：eLife 作者：Arjun Khakhar et al. 单位：University of Minnesota 日期：2020 July 14 摘要 1 生物发光是一种强大的生物信号，科学家已将其用作植物和动物基因表达的报告基因。然而，需要向这些报告者提供底物也有一些缺点，包括其高成本和不均匀的组织穿透。在这项工作中，我们使用可组合的部件工具在植物中重建真菌生物发光途径 (FBP) 。我们证明了 FBP 可以在多种植物的各种组织中产生发光，而无需添加外部底物。我们还展示了如何使用我们的工具箱在植物中部署FBP构建用于研究基因表达和激素通量的自发光报告基因。还描述了一种用于基因表达谱分析的低成本成像平台。这些实验为未来构建可编程自发光植物性状奠定了基础，例如光驱动植物-传粉者相互作用或基于发光植物的传感器。 研究背景 2 为了避免需要递送荧光素底物，最佳解决方案是对植物进行工程改造，以便在每个细胞中产生底物。通过将来自原核生物发光杆菌的 lux 操纵子整合到普通烟草的叶绿体基因组中，证明了一种实现这一目标的方法。虽然观察到自发光，但由于遗传转化的技术挑战，这种方法很难扩展到其他植物。Kotlobay 等人确定了一种真菌生物发光途径 (FBP)，该途径由一组三个基因组成，足以将咖啡酸（一种常见的植物代谢物）转化为荧光素分子。配对的萤光素酶Luz可以氧化萤光素并产生生物发光信号 ( Kotlobay et al., 2018 )。该途径可以进行核编码，克服与质体转化相关的挑战。此外，萤光素酶在绿色光谱中产生光，从而最大限度地减少主要植物色素叶绿素的吸收。这也使其与其他主要的基于荧光素酶的报告基因（如萤火虫荧光素酶）在光谱上可分离，从而能够并行部署这两种报告基因。 技术路线 3
主要结果 4 4.1 植物真菌生物发光通路的重建 我们合成了将咖啡酸转化为 3-羟基组氨酸所需的三个基因的密码子优化版本：来自构巢曲霉的 4'-磷酸泛酰巯基乙炔基转移酶 ( NPGA )、来自Neonothopanus nambi的组氨酸-3-羟化酶 ( H3H )和聚酮合酶 ( Hisp)) 也来自N. nambi（图 1A）。我们还生成了真菌荧光素酶Luz的密码子优化版本。这些 DNA 序列被驯化以去除常用的 II-S 型限制酶识别位点，并与 MoClo 质粒组装试剂盒兼容。该试剂盒可以快速交换启动子和终止子以创建定制的表达盒，通过一步 GoldenGate 反应可以轻松地将其组装成单个 T-DNA。总之，我们的载体可用于构建 FBPs 以实现自发光。
来自不同 FBP 途径变体的瞬时表达的发光表征。 （A）箱形图总结了从被 FBPs 浸润的烟草叶片中记录的发光 3 天后。每个点代表来自不同渗透叶的读数。标记为 agro 的条形是来自用于传递相应 FBP 的农杆菌菌株的汇合培养物的读数。途径二是没有CPH的功能途径，途径六是有CPH的功能途径。通路 8,10 和 11 都是缺少通路酶的阴性对照。（B）为每个表征的途径组装的表达Box的示意图。
当通过农杆菌浸润递送 FBP 三天后对本氏烟草叶片进行成像时，在浸润部位的背景上观察到显着的生物发光（图 1B、C、D）。这表明该途径可以使用天然合成的咖啡酸产生生物发光。将具有完整途径的叶子的发光与缺少途径酶的对照进行比较，仅在完整途径中观察到生物发光信号（图 1-补充图 1D）。这表明在本氏烟草叶中没有天然酶在功能水平上表达，可以补充这些不完整途径中不存在的 FBP 酶的功能。我们还观察到携带该途径的农杆菌融合培养物没有生物发光（图1-图补充件1)，这意味着观察到的生物发光信号不是来自该途径在农杆菌中的表达。
4.2 真菌生物发光途径的稳定整合并创造了自发光植物 我们的实验表明，通过稳定整合生物合成途径中三种酶NPGA、H3H和Hisps、循环途径CPH和真菌荧光素酶Luz的表达box，可以产生自发光植物。我们使用了 FBP图1(FBP-6) 以产生稳定的本氏烟草转基因品系。当在生根培养基上的植物中表征发光时（图1-补充图4A) 或土壤 (图 1F，G,补充图4B），我们观察到整个植物的自发光。在根尖和茎尖分生组织中观察到更强的信号，这与这些组织中更高的细胞密度一致。较年轻的叶子似乎也比老叶具有更低的发光，这表明荧光素底物生物合成存在一些发育一致的异质性，这可能是由于咖啡酸可用性的变化（图 1F，G）。这些结果表明，可以通过生成具有稳定集成 FPB 的植物来产生持续的自发光。
4.3咖啡酸生物合成途径的表达增加了发光 咖啡酸是木质素生物合成的必需中间体，因此在高等植物中普遍存在。然而，咖啡酸水平可能因组织和不同环境条件而异，这种变化可能会使 FBP 报告基因表达的部署复杂化。一种解决方案可能是组成型表达从广泛可用的植物代谢物中合成咖啡酸的酶。为了测试这一点，我们构建了一个 T-DNA 来组成性表达荚膜红杆菌酪氨酸解氨酶和两种大肠杆菌4-羟基苯乙酸 3-单加氧酶成分 (HpaB、HpaC)。这些酶一起催化酪氨酸合成咖啡酸。在将该构建体渗透到稳定表达 FBP 的本氏烟草品系的叶子中后，与在同一叶子的不同部分平行渗透的空载体对照相比，观察到生物发光信号显着增加（补充图3）。
4.4 不同植物的自发光 虽然烟草是一个很好的模型，但 FBP 理论上适用于任何植物，只需要使用适当的启动子和终止子来表达途径酶。为了验证这一假设，我们在多种适合农杆菌转化的植物物种中测试了 FBP。我们将基于农杆菌的 FBP 瞬时递送到模式植物拟南芥和农作物番茄中。在处理过的幼苗的子叶中观察到了背景上强烈的自发光信号（图 2A、B）。我们还对观赏植物大丽花的叶子进行了农杆菌浸润，并再次观察到自发光（图 2C）。最后，我们探讨了 FBP 是否在花瓣中起作用，因为这种组织中的发光在花卉栽培以及工程植物-传粉媒介相互作用方面具有未来的应用。用长春花、矮牵牛花和三种不同品种的红蔷薇（Rose）的花瓣进行 FBP 农杆菌浸润，导致所有花中的自发光具有一系列强度（图 2D、E）。我们还观察到，在花朵与植物体分离后的一天内，信号就会下降，而当花朵与植物体保持连接时，信号会持续存在。这可能意味着某些途径底物或辅助因子是从源组织中转运而来的。然而，需要更多的测试来证实这一假设。这些结果表明，FBP 可以在多种植物中发挥作用。
Fig. 2（A）发光信号叠加在番茄幼苗的明场图像上，通过 AgroBEST 提供 FBP 。较暖的颜色对应于较高的发光信号。( B ) 发光信号叠加在拟南芥幼苗的明场图像上，通过 AgroBEST 提供功能性 FBP（左侧三个幼苗）或破损的 FBP（最右侧幼苗）。( C ) 发光信号叠加在用 FBP 浸润的大丽花叶的明场图像上。( D ) 有光照（左）和无光照、长时间曝光（右）的真彩色图像蔷薇花渗入了 FBP。( E ) 光照（左）和不光照，长时间曝光（右）用 FBP 浸润的红蔷薇花的彩色图像。 4.5 开发低成本、长期生物发光成像系统 由于基质和仪器的高成本，生物发光作为研究生物学动态信号（例如干旱期间 ABA 积累）的工具在环境应用中具有挑战性。FBP 的底物独立性使其比其他生物发光系统更经济。我们利用大量开源软件和现成的硬件组件来设计和构建用于生物发光成像的低成本模块化平台。我们的平台使用 Raspberry Pi 单板计算机作为 DSLR 相机的控制器，配备微距镜头并安装在暗室或弹出式植物生长帐篷中。用于使用该平台控制自定义静止和时间进程成像的代码以及图像处理流程可在 Github 上获得。全部成本不到 2,500 美元，其中大部分用于相机和镜头；更换入门级数码单反相机和套件镜头将使成本低于 2000 美元。设置的程序控制可以在任何联网的计算机上进行。 结论 5 在本报告中，我们证明 FBP 可以将常见的植物代谢物咖啡酸转化为荧光素，并使用它在植物中产生强烈的发光。瞬时表达测定表明 FBP 在广泛的植物物种中起作用。此外，我们展示了如何使用商用摄影设备和开源软件来建立一个相对低成本、模块化和可编程的发光成像平台。 获取原文 6 原文链接： https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC7164954/ 广告 7 |
|
|
