【原】【New Phytol】FveFT2/FveTFL1平衡对于控制草莓的开花至关重要，而FveFT3调节草莓生长和产量

文章信息

题目：The FveFT2 florigen/FveTFL1 antiflorigen balance is critical for the control of seasonal flowering in strawberry while FveFT3 modulates axillary meristem fate and yield

刊名：New Phytologist

作者：Amèlia Gaston et al.

单位：Université Bordeaux, France

日期：15 June 2021‍

摘要

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植物结构是决定作物产量的核心。草莓，一种由匍匐茎产生的子株无性繁殖的作物，果实产量进一步取决于有性繁殖（果实）和无性繁殖（子株）之间的权衡。两者都在很大程度上取决于分生组织的特性，这决定了枝条、匍匐茎和花序的发育。

花起始和植物结构受两种相关蛋白质 FLOWERING LOCUS T (FT) 和 TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) 之间的平衡调节。我们通过基因表达分析、嫁接和遗传转化（过表达和基因编辑）在林地草莓中探索了未表征的FveFT2和FveFT3基因以及花抑制因子 FveTFL1的作用。

我们展示了这些基因的不寻常特性。FveFT2是一种允许短日照 (SD) 开花的非光周期成花素，而FveTFL1是长期假设的长日照系统性抗成花素，它与FveFT2一起有助于开花的光周期调节。我们还表明，FveFT3不是成花素，但在过度表达时会促进植物分枝，这可能是通过改变腋生分生组织的过程，因此以牺牲匍匐茎为代价导致果实产量增加 3.5 倍。我们表明，我们的研究结果可以转化为栽培草莓的改良，其中FveFT2过表达显着加速开花。

技术路线

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主要结果

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3.1 季节性开花[SF]草莓在短日照[SD]条件下开花

当考虑从第n -1年春季播种的种子发出的 [SF] 植物时 ，开花发生在秋季，即在诱导型 SD 条件下；该植物在冬季保持休眠状态，并在第n年的 LD （长日照）中开花（图 1a，b）。相比之下，在永久开花[PF] 植物中，花开始额外发生在冬季休眠后的春季，即通常在不可诱导的 LD 条件下；因此，植物在第n年一直开花直到冬天（图 1b）。我们沿 3 月至 11 月的生长期，研究了F. vesca植物表现出 [SF] 表型（'Norlanska' 基因型）或 [PF] 表型（'815' tfl1基因型）。正如新出现的花序数量所示，[SF] 基因型在有限的 LD 期间（4 月至 6 月）产生花序，而 [PF] 基因型在整个生长季节持续产生花序（图 1c），这与先前对八倍体 [SF] 和 [PF] 基因型的观察相同。

接下来，我们通过评估立体显微镜下的 SAM 阶段，彻底表征了 SD 中的花起始，从 6 月到 10 月（图 1d）。为此，当顶端圆顶相对平坦并且倾向于部分封闭在最年轻叶子的发育托叶中时，我们认为分生组织是植物性的。花开始的第一个迹象是当分生组织圆顶高于发育中的托叶，并且形状变得宽而凸出时（图 1d，  S1）。在 [SF] 'Norlanska' 中，开花发生在 10 月初（11:30 日长和平均温度 17°C）（图 1e）。在[PF]'815'中，从春季到晚秋连续观察到开始的顶芽。这些结果表明，在所研究的自然环境条件下（法国西南部），SD 光周期（<12 小时）在F. vesca 'Norlanska' [SF] 草莓基因型中是可诱导的。

3.2 季节性开花可能受非光周期开花激活因子FveFT2和 LD 表达的开花抑制因子FveTFL1之间的平衡控制

为了进一步了解 SD（短日照）光周期中的花起始以及花激活因子/抑制因子平衡如何调节草莓的季节性开花，我们研究了来自F. vesca的 FT/TFL1 蛋白。CETS 家族蛋白的系统发育树分析突出了单个进化枝中的三种F. vesca FT 蛋白和另外两个进化枝中的三种 TFL1 蛋白（图 2a；表 S2 )。Fragaria Fve FT1 与Rosa Rc FTb分为一组，Fve FT2 和Fve FT3 与Rc FTa为一组，表明在这些近属分离之前可能存在 FT 重复。FveFT1最有可能与RcFTb和FveFT2与RcFTa直系同源，因为它们在物理上位于同线区域。因为FveFT1是一种 LD 开花激活剂，我们专注于FveFT2和FveFT3，它们是潜在的 SD 开花激活剂，并表明它们可以成功地补充晚开花的拟南芥ft-1突变体（图 S2）。

然后，我们分析了在 SD 诱导光周期（10 月 15 日，秋季）和 LD 非诱导光周期（6 月 5 日，春季）下生长的植物的各种器官中三种FveFT和FveTFL1的表达模式（图 S3）。在 SD 下的 [SF] 基因型中，在叶子中仅检测到FveFT2（图 S3）。此外，无论光周期、SD 或 LD，或开花行为、[SF] 或 [PF] 如何， FveFT2都在叶片中表达。在 [SF] 叶中，FveFT1和FveTFL1也在叶中表达，但仅在 LD 下表达。FveFT3从未在叶子中检测到。在 LD 下的 [SF] 和 [PF] 中，所有三个FveFT和FveTFL1都在花中额外检测到。[SF] 匍匐茎尖端仅检测到FveTFL1 （[PF] 植物未产生匍匐茎）。在叶柄中仅检测到FveFT2和FveTFL1，它们的表达高度依赖于基因型和光周期。

因为光周期和生物钟之间的串扰可能控制成花素的表达，我们接下来在24 小时内监测了三个FveFT和FveTFL1叶片中的表达。在 SD（9 月 20 日，秋季）或 LD（5 月 31 日，春季）光周期中每 2 小时对自然条件下生长的 [SF] 和 [PF] 植物的叶子进行采样（图 2b，c）。FveFT1的表达在白天从 [SF] 基因型的 LD 收集的叶子中突出。在 [SF] 和 [PF] 基因型中，全天 FveFT2表达低且几乎稳定，SD 植物在中午过后和 LD 植物日落前有一个表达峰值。无论一天中的什么时间，在叶子中都没有检测到FveFT3 。FveTFL1的表达仅限于 [SF] 基因型的 LD 叶片中的白天，几乎与FveFT1 一样，但在 [PF] 中未观察到无论采样光周期或一天中的时间。

我们进一步探索了从 6 月到 11 月跨越 SD 和 LD 光周期的时间范围内的FveFTs和FveTFL1表达模式。FveFT1表达仅限于 [SF] 基因型中的 LD。此外，在 [PF] 中，FveFT1表达与 [SF] 中的表达异相，这表明其在 SD 下的表达在某种程度上被tfl1突变失调。无论遗传或环境背景如何， FveFT2在整个生长季节都被微弱但连续检测到（图 2d）。

在 [SF] 基因型中， FveTFL1在 LD 中表达，但在 SD 中不表达。FveTFL1 [PF] 植物中缺乏检测可能是由tfl1突变引起的转录不稳定性引起的。为了获得更多证据表明FveFT1依赖于 LD 并且 FveFT2 不依赖于光周期，我们进行了两个平行实验，其中在相同条件下生长直到 7 月 15 日 (LD) 的植物要么保持在自然光条件下，要么转移到恒定受控的 LD 条件下，直到 11 月（图 2d，e）。FveFT1在 [SF] 基因型的 SD 下不表达（图 2d），在恒定 LD 下保持高表达水平（图 2e )，表明它对 LD 光周期的依赖性。正如预期的那样，FveFT2被证明对光周期在很大程度上不敏感，因为它在 SD 和 LD 下都表示（图 2d，e）。不出所料，在 [SF] 植物（图 2d）中未在 SD 下表达的 FveTFL1 与 FveFT1 一样，仍然在维持在 LD 下的 [SF] 植物中检测到。

总之，这些结果表明Fve FT1 是一种仅限于 LD 光周期的花激活剂，其作用可以被花抑制因子 Fve TFL1抵消。在缺乏FveTFL1表达的[PF] 植物中，这种激活/抑制平衡可能会被破坏，其中Fve FT1 可以作为 LD 花激活剂发挥作用。因为日长不敏感的FveFT2是唯一的草莓FT在叶片和诱导型 SD 光周期下均检测到该基因，是季节性成花素的理想候选者。相反，没有任何线索表明FveFT3是一种成花素，无论在什么情况下，在叶子中都没有检测到。FveTFL1在叶片中的显着表达进一步表明它可能发挥其 LD 花抑制功能。

3.3 FveFT2花激活剂和FveTFL1花抑制因子形成移植物传递信号

为了测试推定的FveFT2成花素和FveTFL1 抗成花素长距离作用的可能性，我们基于FveFT2和FveTFL1在烟草中的稳定表达和转基因烟草的嫁接，实施了烟草嫁接实验。芽到非转基因烟草原料上（从这一点向前命名为野生型（WT）（图 3a）。第一代转基因植物的表型与预期一致：表达FveFT2 ( 35S::FveFT2 Nt )的烟草品系开花早，而表达FveTFL1的品系（35S::FveTFL1 Nt）开花较晚（图 S4）。对于每个构建体，将三个独立的转基因系移植到 WT 原种上。库存上的最后一个 AXM 作为对照保留。它的作用是表明花卉信号是否可以从接穗转移到砧木并影响 AXM 对砧木的作用。

在嫁接后1个月和3个月检查指示芽的发育状态，将其分为四类：营养型、初花期、全花期和产果期。嫁接后一个月，指示芽主要是营养的或在对照嫁接中开始开花（图 3b）。在35S::FveFT2 Nt/WT嫁接的植物，大多数指示芽在结果中，而其他在开花类别中，从而表明指示芽中开花的加速。相反，35S::FveTFL1 Nt /WT 嫁接植物保持营养状态。嫁接后3个月，WT/WT和35S::FveFT2 Nt /WT嫁接植株的指示芽均结果，而35S::FveTFL1 Nt /WT嫁接植株的指示芽仍处于营养状态，甚至坏死，说明有很强的延迟的发展。总之，这些结果表明Fve FT2 和FveTFL1分别是能够加速或抑制开花的长距离移动信号，这与其在草莓中的成花素和抗成花素功能一致。

3.4 FveFT2 的失调强烈影响二倍体草莓F. vesca的开花

为了进一步研究草莓中Fve FT2 成花素和密切相关的Fve FT3 的作用，我们产生了在对照下过表达FveFT2 ( 35S::FveFT2 FveOE )或FveFT3 ( 35S::FveFT3 FveOE )的转基因F. vesca二倍体草莓植物35S 启动子。我们使用了 'Hawaii-4' 基因型，一种 [PF] tfl1突变体，通常用于F. vesca遗传转化。考虑到基因结构对基因调控和功能的潜在影响），我们进一步使用基因组 DNA 进行植物转化。

FveFT2和FveFT3的过表达（图 S5）显着影响了花和匍匐茎生产之间的平衡（图 4a，b）。35S::FveFT2 FveOE T0 植物显示出惊人的早熟开花表型，甚至可以在小植株转移到土壤之前在体外产生花序（图 4a，c）。此外，35S::FveFT2 FveOE T0 植物（图 4b）表现出严重的矮化和无匍匐茎表型（图 4d ）)，其特征是在体外转移到土壤后 10 周产生大量的花序，每株植物多达 20 个花序（图 4c）。与有限数量和小尺寸的叶子相关的花序的持续产生最终导致植物死亡。相比之下，FveFT3对开花的影响非常有限，无论它与FveFT2共享的高氨基酸同一性（约85%）如何。35S::FveFT3 FveOE T0植物类似于'Hawaii-4'（图 4a）并且在体外不早开花（图 4c ）。 它们比'Hawaii-4' WT（图 S6 ）稍早开花（9天; P = 0.04），并且在体外转移到土壤后10周时有更多的花序（图 4c）。

鉴于FveFT2对开花的强烈影响，我们通过 'Hawaii-4' 的 CRISPR/Cas9 基因编辑产生一系列FveFT2等位基因突变体，进一步探索了其花激活剂功能。我们选择了三个显示不同突变的CR-FveFT2系。FveFT2序列中的两个不同 T 插入导致在CR-fveft2#1和CR-fveft2#2系中产生不同的截短蛋白（图 4e，f）。CR-fveft2#3系中的一个大的 87-bp 缺失在蛋白质中产生了一个框架内的 29 个氨基酸缺口（图 4e，f）。正如所料，所有的CR-fveft2分析的突变体显示出晚开花表型（图 4g，h）。虽然 100% 的 'Hawaii-4' WT 植物在播种后 5 个月时已经开花，但大约 40% 的CR-fveft2#2和CR-fveft2#3突变体植物在 5.5 个月时尚未开花（图 4h）。CR-fveft2#1突变体直到 5.5 个月才开花。

3.5 FveFT3在F. vesca中的过表达对植物结构和果实产量有很大影响

根据所考虑的基因，FveFT2和FveFT3过表达对植物结构的影响也有很大不同。35S::FveFT2 FveOE T0 植物表现出发育不良的表型，而35S ::FveFT3 FveOE T0 植物表现出非常浓密的表型（图 5a、b）。两者都显示出匍匐茎产量的急剧减少（图 4d）。为了进一步研究这些表型差异的起源，我们剖析了 T1 转化体的结构。35S::FveFT2 FveOE T1 植物表现出短的主冠，有四片或五片叶子（图 5a）。几乎所有来自冠部的 AXM 都发展成一个非常短的 BC，在产生一片叶子后，很快就被一个花序终止。相比之下，在35S::FveFT3 FveOE T1 植物中重新编程的 AXM 导致在三片或四片正常叶片后产生新的带有花序的 BC，而不是匍匐茎（图 5a）。每个 BC 出现两个新的 BC，因此解释了在 T0 和 T1 植物中观察到的浓密表型（图 4a、b、  5a）。

3.6 FveFT2还促进八倍体栽培草莓的早期开花

为了研究我们的发现在栽培的八倍体草莓中的潜在生物技术应用，我们随后在八倍体草莓季节性开花 [SF] 基因型“Sveva”中过表达了非光周期成花素 FveFT2 （图 S8）。在获得的所有四个独立的F × ananassa 35S::FveFT2 Fa0E 'Sveva' 品系中，FveFT2过表达对开花和匍匐茎的产生有重大影响，因为这些35S::FveFT2 Fa0E品系在体外开花早熟并且不产生匍匐茎（图 6 )，如F. vesca 35S::FveFT2 Fve0E线。为了验证这种效应是否由于主要花激活剂或阻遏剂的失调，我们分析了F. × ananassa 35S::FveFT2 Fa0E系中FaFT1和FaTFL1的表达。FaTFL1表达没有改变，而 FaFT1 表达的显着变化（图 S8）独立于在所有分析的品系中观察到的非常早开花的表型（图 6）。

结论

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我们揭示了草莓中使开花适应光周期并控制开花和无性繁殖之间权衡的主要机制。图 7a中提出了草莓中光周期开花途径的简化视图，而图 7b中总结了通过Fve FT2、Fve FT3 和Fve TFL1之间的相互作用对草莓植物结构的调节。我们通过光周期不敏感的成花素FveFT2和光周期敏感的抗成花素FveTFL1之间的平衡以及FveFT3的新功能化，为季节性开花的调节带来了新的见解来控制AXM的命运。此外，我们的研究结果对草莓改良具有重要意义，因为我们成功调节的两个性状，即开花早熟和产量，是主要的育种目标。开花信号的定量调整可以显着提高许多作物物种的生产力。在草莓中，旨在鉴定此处描述的开花途径基因的天然或编辑遗传变异的未来研究（图 7a）应该有助于创造优良品种。

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原文链接：

https://nph.onlinelibrary./doi/10.1111/nph.17557

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