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作者：王硕，南京农业大学博士在读。主要研究利用噬菌体防治土传病害。
 人类肠道中的土著噬菌体群落对细菌群落的结构和功能有着巨大的影响，但噬菌体群落在种群水平的变异尚未得到充分研究。本研究分析了4198个个体的肠道dsDNA噬菌体群落。通过整合宏基因组数据，发现了数千个高质量的噬菌体基因组，其中包括以前没有特征的噬菌体分支，其细菌宿主与已知的主要宿主不同。宿主细菌的分布是噬菌体在肠道内分布的一个重要决定因素，噬菌体多样性与细菌的抗病毒防御机制高度相关，如CRISPR-Cas和限制性修饰系统。作者确定了97种显著影响病毒组结构的各种内在和外在因素，包括年龄、性别、生活方式和饮食，其中大多数与噬菌体及其预测的细菌宿主具有一致的相关性。综上，这些结果为了解人类肠道中细菌及其噬菌体的共生群落提供了基础。 一、日本4D微生物群落噬菌体基因组目录的构建 在序列相似性>95%的条件下，将4709个噬菌体序列聚类后产生1347个病毒操作分类单元（vOTU）（图1a）。据预测，目录中的大多数噬菌体属于有尾噬菌体目，其中长尾噬菌体科、短尾噬菌体科和肌尾噬菌体科最为丰富（图1b）。使用CRISPR间隔物对vOTU的宿主预测表明，预测宿主中最常见的细菌门是厚壁菌门，其次是拟杆菌门和放线菌门（图1c）。在属水平上，宿主主要是拟杆菌属、瘤胃球菌属、布劳特氏菌属和双歧杆菌属（图1f）。在预测其宿主的vOTU中，大多数噬菌体（71.1%）被预测只能侵染一个属（即专性噬菌体），而其他噬菌体（28.9%）被预测可以侵染多个属（如通用噬菌体，图1d）。对预测宿主的噬菌体进行比较后发现，拟杆菌门的噬菌体具有相对较大的基因组，而放线菌门噬菌体的基因组较小（图1f），与宿主基因组大小的变化相一致。此外，不同属的专性噬菌体和通用噬菌体的比例差异很大，其中大多数预测侵染双歧杆菌属、链球菌属和栖粪杆菌属的噬菌体是专性噬菌体，而梭菌属、罗氏菌属、真杆菌属噬菌体很可能是通用噬菌体（图1f）。裂解性噬菌体和温和噬菌体的比例也因宿主而异；据预测，Odoribacter、拟杆菌属和副杆菌属噬菌体的大多数具有裂解性，而罗氏菌属、Dorea和Anaerotipes噬菌体是温和的。为了阐明vOTU之间更为遥远的关系，进一步根据共享蛋白的比例（>20%）对vOTU进行聚类，共产生223个病毒簇（VC），对应于家族或亚家族水平。分析表明，VC的数量在本研究的个体数量上达到饱和（图1e）。
图1 来自4198个人类肠道宏基因组的重建噬菌体基因组概述 研究还发现了几个VCs，其丰度与VC_19的数量级相同（图2a）。在这些丰富的VCs中，VC_6是一组crAss样家族，VC_1中的噬菌体与最近提出的Gubaphage或Flandersviridae的新分支相似。其他七个丰富的VCs（VC_2、24、12、15、3、44和18）与RefSeq中的已知噬菌体没有任何相似性，这表明它们是新的噬菌体分支，但在人类肠道中广泛存在。24.6–90.2%的个体中检测到这些噬菌体，并预测它们会侵染主要的肠道物种，如拟杆菌属、普雷沃菌属、罗氏菌属或双歧杆菌属等。通过搜索温和噬菌体的特异基因或与RefSeq中的参考微生物基因组进行比较，发现新的噬菌体进化枝VC_2、24、12、3和15可能具有溶原生命周期，而其他（VC_44和18）则没有。基于大终止酶、门户蛋白和主要衣壳蛋白的系统发育分析表明，7个VCs中的大多数是单系的，与RefSeq中已知的参考噬菌体明显不同（图2c）。此外，噬菌体之间的基因组相似性表明，同一VC中的大多数噬菌体聚集在一起，与其他VC中的噬菌体不同（图2b）。为了调查本研究中新发现的VC是否作为病毒颗粒存在于人体肠道中，作者在VLP数据集中对其进行了研究。结果发现，在24个VLP数据集中检测到了10个丰富的VCs，它们在VLP基因组中的相对丰度平均比从相同粪便样本中制备的整个基因组中的丰度高4.5–1115倍，清楚地表明它们在肠道中以病毒颗粒的形式存在。
图2 鉴定人类肠道中丰富且普遍存在的新型噬菌体聚类 三、肠道噬菌体群落和细菌群落之间的密切相互作用 研究比较了从4198个个体中收集的噬菌体和细菌特征，发现它们之间的α多样性（香农多样性）和β多样性（布雷-柯蒂斯距离）显著正相关（图3a和b）。这一结果表明，人类肠道中的噬菌体群落和细菌群落结构密切相关。研究还发现，噬菌体群落的β-多样性显著高于细菌群落（图3b），这表明每个个体的噬菌体群落比细菌群落更具特异性。为了进一步探索它们之间的联系，接下来在4198个个体中，检验了每个噬菌体属水平的相对丰度与其预测宿主之间的一对一相关性。发现它们之间的平均rs为0.18，呈正相关（图3d），这表明噬菌体和宿主细菌物种在人类肠道中是共存的，而不是相互排斥的。巨单胞菌属、大肠杆菌属、普雷沃菌属和乳酸杆菌属与其噬菌体的相关性相对较高（图3c）。原因可能是侵染这些属的专性噬菌体的比例高于其他属，例如梭菌属、瘤胃球菌属和泰泽雷拉菌属等，这些属通常被通用噬菌体侵染（图3c）。事实上，专性噬菌体与其宿主的相关性明显高于一般噬菌体（图3d）。为了探索抗病毒基因与噬菌体群落之间的关联，进一步量化了这些基因，并评估了它们与噬菌体群落结构的关系。结果发现，在具有丰富防御机制的样本中，噬菌体群落的香农多样性显著高于所有三个系统的低丰度样本（图3e）。此外，还发现CRISPR-Cas和RM系统中的各种亚型之间存在显著的正相关关系（图3f）。
图3 肠道噬菌体群落和细菌群落之间的密切相互作用 四、与噬菌体群落相关的宿主和环境因素的综合鉴定 为了研究肠道噬菌体群落结构如何与宿主生理和环境因素相关，对年龄和性别进行了关联分析，年龄和性别是肠道细菌群落结构的重要决定因素。年龄与噬菌体群落多样性呈显著正相关（图4a），同时年龄与细菌群落多样性呈正相关。年龄与变形杆菌噬菌体和宿主未知的噬菌体呈显著正相关，但与放线菌噬菌体呈负相关（图4b）。多变量分析表明，年龄与176个vOTU有显著关联（图4c），包括与梭状芽孢杆菌、瘤胃球菌、粪杆菌以及宿主未知的噬菌体呈正相关。性别与68个 vOTU和24个VC有显著相关性（图4d）。接下来对4198名患者的噬菌体特征和232个宿主/环境因素进行了关联分析。冗余分析表明，这些因素解释了vOTU水平上病毒组总方差的0.6%（图5a），大大低于物种和属水平上肠道细菌群落中相同因素解释的值（图5a）。方差的排列分析表明，232个因子中有97个与噬菌体群落变异显著相关，其中年龄与噬菌体群落的相关性最强（图5b，d）。显著相关因素包括各种疾病、药物和饮食。每个因子解释的变异在噬菌体群落和细菌群落之间高度相关（图5c）。crAssphage的vOTU（vOTU_974）与该类人群中的任何数据均无显著相关性，表明存在未知宿主、环境或生态因素，可以解释人类肠道中这种最丰富噬菌体的变异。在具有统计意义的97个因素中，大多数与噬菌体群落和细菌群落都有很强的相关性（图5d）。相比之下，质子泵抑制剂对肠道菌群的影响最强，对噬菌体群落的影响相对温和（图5d）。
图4 人类肠道噬菌体群落的年龄和性别相关变化
图5 与肠道噬菌体群落显著相关的宿主和环境因素 这篇文章首先利用4198个不同个体的肠道噬菌体群落构建肠道噬菌体目录，分析这些噬菌体的宿主和多样性并发现了很多新的噬菌体分支，这些噬菌体的宿主也与已知的主要宿主不同，是一些全新的肠道噬菌体。接下来分析了噬菌体群落与细菌群落的相互作用关系，发现噬菌体多样性与细菌的抗噬菌体机制高度相关。最后研究了影响肠道噬菌体群落和细菌群落的宿主和环境因素，确定了97种显著影响噬菌体群落结构的各种内在和外在因素，包括年龄、性别、生活方式和饮食，其中大多数与噬菌体及其预测的细菌宿主具有一致的相关性。 论文信息 原名：Extensive gut virome variation and its associations with host and environmental factors in a population-level cohort 译名：肠道噬菌体组种群水平变异及其与宿主环境的关系 期刊：Nature Communications DOI：10.1038/s41467-022-32832-w 发表时间：2022.08 通讯作者：Suguru Nishijima 通讯作者单位：早稻田大学 |
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