 浅论类器官助力奥密克戎研究  知识背景： 2021年11月9日，南非首次从病例样本中检测到一种新冠病毒B.1.1.529变异株。短短2周时间，该变异株即成为南非豪登省的绝对优势变异株，增长迅猛。11月26日，WHO将其定义为第五种“关切变异株”（ VOC），取名 奥米克戎（奥密克戎），其刺突蛋白中携带了超过30个突变，现在正以迅猛的速度在国际上传播。  图1 刺突蛋白德尔塔和奥米克戎的变异结构比较 令人恐惧的是，即使已经接种第二针疫苗，但各地仍有多例感染病例出现，这表明奥米克戎很可能对接种疫苗产生的抗体有明显的逃避作用，那为什么卫健委一再宣传接种第三针的必要性？奥米克戎又为什么令人闻风丧胆？它和之前的毒株相比又有什么不同？ 你问我答： 自从奥米克戎出现以来，曾因为高传染率和 HIV 的产生背景引起一阵恐慌，但随着人们对它的研究，发现奥米克戎具有上呼吸道感染、病情较轻、感染年轻化等特征。来自英国剑桥大学的研究人员决心研究奥米克戎的相关发病机制，了解为什么这个变种会突然间爆发出来？为什么感染特征与之前毒株不相一致？ 为什么奥米克戎主要表现为上呼吸道感染？ 猜想可能与奥米克戎上的S蛋白突变引起致病机制的改变有关，因为奥米克戎在n端结构域和受体结合域上存在20多个取代基，在S2中也有6个独特的突变，这些取代基和突变很有可能会影响奥米克戎的致病机制。 首先我们要知道新冠病毒的进入细胞途径主要有两种，一种是病毒通过胞吞方式进入细胞——病毒以网格蛋白依赖性方式与ACE2（血管紧张素转化酶2）结合并内在化，通过胞吞进入细胞，再通过蛋白酶(例如Furin蛋白酶)介导S蛋白激活促进膜融合，使得病毒的RNA被释放到细胞质中，从而引发宿主细胞感染；另外一种是病毒通过与细胞膜直接融合进入宿主细胞——胞膜融合方式也需要病毒表面S蛋白与细胞上ACE2受体相结合，而这种进入方式需要辅助结合因子的参与，目前已知关系最为密切的是TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶），它能够协同激活S蛋白，通过促进胞膜融合使得病毒进入宿主细胞。  图2 SARS CoV-2已知的两种细胞进入途径 与之前的毒株相比，奥米克戎进入细胞方式的不同在于选择更多以胞吞方式进入细胞，而这种改变归因于TMPRSS2对奥米克戎作用减弱，而奥米克戎对ACE2亲和力升高，所以奥米克戎对高表达TMPRSS2的下呼吸道的感染率下降，而低表达TMPRSS2的上呼吸道感染多见。 为什么低表达TMPRSS2的上呼吸道易感染？ 通过建立类器官模型（下呼吸道、胆囊）和使用常用细胞系作为研究对象，研究人员发现在高表达TMPRSS2的细胞中，奥米克戎检出率较低，而在高表达ACE2的细胞中，奥米克戎的检出率与其他毒株没有明显的差异。这意味着这意味着奥米克戎和德尔塔对低表达TMPRSS2的上呼吸道的易感性相似，而对于高表达TMPRSS2的细胞群易感性出现差异，提示TMPRSS2可能在奥米克戎中作为辅助结合因子的作用变得相当有限，最可能的解释是奥米克戎缺乏多碱基切割位点，使其没有在生产细胞中被切割，而是被TMPRSS2或核内体中的组织蛋白酶在靶细胞表面切割，通过降低刺突切割效率，损害TMPRSS2介导的胞膜融合路径来促进胞吞作用，此外还可能与诸多累积的基本氨基酸突变，导致S蛋白总电荷的增加，使S蛋白对低pH诱导的构象改变更加敏感，有利于利用上气道低pH环境通过胞吞进入宿主细胞。  图3 各种细胞复制率差异比较 黑色（武汉毒株）；橙色（德尔塔）；灰色（奥米克戎）  图4 下气道类器官亮场图像  图5 胆管细胞类器官亮场图像  图6 类器官入口检测感染示意图 除了TMPRSS2因素外， 还有导致易感染的因素嘛？ 奥米克戎对ACE2受体的亲和力增强约3倍，这可能是相对于其他毒株更加易感染的一个因素。研究人员利用生物层干涉法测定了人ACE2受体与奥米克戎毒株、武汉毒株和德尔塔毒株亲和力的差异，结果奥米克戎的对ACE2的结合亲和力增强约3倍。为什么会这样呢？因为已突变的氨基酸能够与ACE2上的残基结合引入额外的静电相互作用，也有的突变氨基酸能够与ACE2形成氢键，所以虽然也有突变氨基酸会抑制ACE2结合，但总体上突变的受体结合域上的氨基酸增加了奥米克戎对ACE2的亲和力。 图7 刺突蛋白德尔塔和奥米克戎的变异结构  图8 人ACE2与SARS-CoV-2 VOC结合的动力学分析 为什么奥米克戎重症病人不多？ 降低对TMPRSS2的依赖性，不仅意味着好发感染的部位发生了改变，而且还意味着毒株致病力的下降。奥米克戎更加倾向于感染上呼吸道，而不是下呼吸道，这使得奥米克戎更加类似于常见的上呼吸道病毒感染性疾病——病毒性感冒，对于重要脏器侵袭的减少是奥米克戎重症患者少的主要原因。除此之外，奥米克戎的致病力也有所下降，研究人员在半固态介质系统培养被毒株感染的细胞，结果显示与德尔塔相比，奥米克戎的斑块尺寸更小，较小的病灶可以归因于病毒进入细胞方式的改变。在体内较小的病灶可能意味着良好的预后，这帮助解释了为什么奥米克戎的重症患者很少。  图9 德尔塔和奥米克戎活病毒形成的感染灶 图10 培养德尔塔和奥米克戎感染灶大小和数目差异 疫苗对奥米克戎还管用吗？ 奥米克戎对接种疫苗产生的多克隆中和抗体表现出免疫逃避作用，意味着病毒受体结合域中I-IV类抗原区域很可能发生了突变。研究人员验证了临床常用治疗性单克隆抗体对于治疗奥米克戎的有效性，结果这些单抗对德尔塔有不错的作用，但对奥米克戎，无论是单独或联合使用单抗，都完全丧失了抗体对奥米克戎的中和作用。 这可能是由于突变的氨基酸阻碍了单抗与奥米克戎的结合所致的，理论上奥米克戎中突变的氨基酸（K417N, E484A, S477N和Q493R）可以排除与单抗（REGN10933）的结合，而突变的G446S则与单抗（REGN10987）的结合相冲突，因此奥米克戎 受体结合域和S三聚体的结合减弱以及抗体中和作用损失一致。此外，有研究表明病毒表面S蛋白若出现K417N、E484A或N501Y突变，很可能提示病毒免疫逃逸能力增强，奥米克戎刚刚出现的时候之所以被预测具有高致病性和高感染率，就是因为在奥米克戎上检测到这三种氨基酸突变的存在。 不过奥米克戎对于RNA聚合酶抑制药物还是无能为力的，相关药物能通过抑制RNA聚合酶阻止病毒逆转录和自我复制的过程，让病毒难以自我复制和繁殖，面对德尔塔和奥米克戎都有不错的抗病毒活性。 图11 两种单抗以及联合物抗德尔塔和奥米克戎效果滴定 图12 RNA聚合酶抑制药物抗德尔塔和奥米克戎的剂量反应曲线 既然中和抗体对奥米克戎作用有限， 那还有必要接种疫苗嘛？ 当然有必要，接种第三针疫苗能够有效降低感染患者的易感性和重症率！为了探究疫苗诱导的多克隆中和抗体能否中和奥米克戎，研究人员将40个接种两针疫苗的血清样本与 PV（假型病毒）粒子混合前，进行血清滴定，结果表明与德尔塔相比，第二剂后奥米克戎的中和作用损失10倍以上，而如果使用第三剂疫苗进行增强的话，对所有变种均能观察到中和作用显著增加。 图13 第2针疫苗后的3个时间点上对PV的中和作用 图14 第3针疫苗后的3个时间点上对PV的中和作用 研究意义 ①研究发现第二针疫苗诱导的中和抗体对奥米克戎中和作用有限，而中和作用可以通过接种第三针疫苗大大增强，这对于宣传第三次疫苗接种工作而言至关重要，所以看完了快点去打第三针疫苗吧！ ②研究发现临床常用的单抗对奥米克戎治疗效果不佳，但通过RNA聚合酶抑制剂对奥米克戎效果显著，为临床药物治疗提供了新的指向。 ③研究解释了奥米克戎在临床表现上为什么不同于以往毒株，表现为上呼吸道感染、能够逃避免疫反应以及重症感染少等的原因。 ④研究发现奥米克戎致病机制以往毒株不同，虽然在入侵细胞的时候，依然把ACE2作为重要的受体分子，但不再依赖TMPRSS2作为重要辅助分子且其可能受到ACE2水平不同影响，这意味新冠变异速度非常快，绝对不能掉以轻心。 结 / 语 研究人员从刺突介导的免疫逃避、ACE2结合的相互作用和决定组织取向的细胞进入途径等方面探讨了奥米克戎的生物学特性，通过使用类器官模型和多种培养检验技术，揭示了奥米克戎在细胞偏好上的差异，这受到很多限制：首先尽管使用的是原代人体组织，但体外培养系统和人体内还是有差异的；其次TMPRRS2的水平可能影响ACE2，特别是TMPRSS2与ACE2的裂解有关，具体效应大小受到ACE2表达的影响；最后特异性蛋白酶抑制剂除了抑制细胞组织蛋白酶外，还可能抑制病毒蛋白酶，这可能影响观察到的结果的准确性。虽然存在种种遗憾，但研究也为未来的研究方向指出了道路，奥米克戎刚刚出现的时候，有研究通过检测病毒表面的氨基酸突变预测奥米克戎具有高度的传染性和致病性，但实际表现中尽管奥米克戎具有较高的传染性，但是致病性并不强，为什么会出现这样的偏差？原因尚不得而知，可能与氨基酸突变之间的相互作用有关，这表明仅基于序列对复制和趋向性的预测可能具有误导性，随着变异的不断出现，对趋向性变化的详细分子理解至关重要。 在本研究中，类器官充当了一个再现原始组织形态特征的体外培养模型，用于在实验样本量不足的情况下，扩增培养以获取足够高质量样本的目的，尽管类器官目前相关技术还未成熟，相关标准尚未制定颁布，但是已经能够在科研中逐步应用研究，并取得了较好的成果，获得了世界各地科学家的认可，相信在不远的未来，类器官技术将能够成为新一代成熟的体外培养模型，更多的造福人类的健康！ END 文章涉及的参考文献的获取方式： |
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