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多重免疫荧光技术原理介绍 多重免疫荧光技术是一项基于酪胺信号放大（TSA）的免疫染色技术，酪胺盐在辣根过氧化物酶（HRP）催化下，形成具有高活性的酪胺自由基，自由基与组织抗原周围的富电子酪氨酸残基共价结合并大量沉积。这些共价结合的沉积物比以氢键形式结合的一抗和二抗更稳定，使用洗脱液进行微波处理能够轻松洗脱氢键结合的一抗二抗，而以共价键形式结合的酪氨酸荧光基团则永久沉积在抗原位点上。最后通过酪胺分子上携带的荧光基团检测到荧光信号得到抗原信息。因为能够洗脱一抗二抗，对标记其他的一抗二抗及不同的荧光基团不会产生影响，因此允许在同一切片上使用同一种属来源的不同一抗进行多重标记，并通过多光谱成像系统获得高信噪比的图像。  TSA标记及洗脱示意图 实用小技巧分享 切片准备 1.1在选择载玻片的时候，要考虑到后期实验需要反复微波加热洗脱，需要选择粘附载玻片（防脱载玻片）。 1.2在进行切片时，建议的切片厚度为3μm，像脾脏、淋巴结等细胞比较致密的组织建议切片厚度为1-2μm，更薄的组织片能得到更清晰的图片。 抗体的选择 选择抗体时，要从抗体的官网信息或者抗体说明书核对抗体信息是否符合实验需求，需要核对的内容主要有抗体名称（大多数抗体会有不一样的别称）、抗体种属及反应种属、抗体应用方向（多重免疫荧光的抗体需要能应用于IHC）以及使用的参考比例等，如下示例：   使用免疫组化的方法来验证抗体 3.1根据抗体说明书确定实验时的抗原修复方式是使用枸橼酸修复还是EDTA修复，若在应用中没有说明，建议可以先使用EDTA碱性修复进行实验。 3.2抗体的使用比例可以使用两个或者三个，比如抗体说明建议比例为1:50--1:200，在具体实验时就能设置1:50、1:200和1:400三个比例，也可以设置1:100和1:300两个比例进行实验。 3.3实验时需要设置阳性对照和阴性对照（空白对照），阴性对照可以使用不加抗体的方式进行，阳性对照需要进行信息查询，使用对应阳性组织来进行，例如在做CD3、CD4及CD20等淋巴细胞相应指标时，可以使用扁桃体样本作为阳性对照。 3.4如何判断抗体是否可以用作后续的多色实验，要了解抗体表达的定位，通过阳性对照和阴性对照判断特异性强，染色背景干净，延长显色时间也不会出现明显背景着色，后续可应用单染荧光素来确认效果，如图较好的组化效果：   多重免疫荧光实验 4.1荧光染料搭配原则：弱配强原则，即表达较弱的抗体搭配荧光激发较强的染料，表达较强的抗体搭配荧光激发较弱的染料。 4.2在确定染色顺序时，表达丰度高的指标可以考虑先染色，因为多轮次的循环微波洗脱修复可以提升抗原的敏感度，更容易检出，所以低表达指标可以放在靠后进行染色。 4.3每做一次不同的多重免疫荧光实验，建议使用同样的样本类型跟着实验流程做一个染料对应的单染，可以用作在图片拆分时建立独立的拆分光谱，系统自带光谱和实际样本建立的独立光谱会存在细微差别，如图所示：   其他注意事项 5.1整个实验过程要避免干片。 5.2免疫组化油性笔在圈组织时要和组织片保持合适的距离，防止油性物质沾到组织上。 5.3多重免疫荧光实验封片时选择含有抗荧光淬灭剂的水溶性封片剂，封片剂滴加不宜过多，不能有大量气泡和溢胶。 武汉生物样本库有限公司搭建有成熟一站式服务的高通量测序、单细胞测序、空间转录组、蛋白组学、流式细胞、多重免疫荧光平台。其中流式细胞已在近10年的科技服务经验上，为多家单位提供科研思路，解决项目痛点，助力项目申请，协助发表多篇高分文章。2022年新搭建多重免疫荧光平台，可提供组织石蜡切片9色以内的检测服务及80片装载高通量扫片及个性化的深度分析，目前已开展了内部抗体及成熟panel测试和外部项目对接，部分结果展示如下：     文案 | 牟 涛 设计 | 李 敏 审校 | 韦子尧 |
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