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我们之前的创新者系列文章介绍了测序技巧以及对ATAC-seq文库制备扩增方案的策略改变（点击阅读相关文章）。重点介绍了斯坦福大学和陈·扎克伯格生物中心的研究成果，它整合了单细胞CRISPR筛选和单细胞ATAC-seq。这种方法既能检测基因组中的开放染色质区域，了解转录因子活性，又能检测单链向导RNA，观察其对同一批转录因子的扰动效应。阅读下文，了解科学家们如何使用这种技术在癌细胞的基因调控机制上作出新发现。 创新者系列文章关注那些由10x Genomics客户取得的研究成果--他们通过采用基于Chromium单细胞或Visium空间技术分析展示了其科学独创性。这些创新之所以与众不同，是因为其原创性及其对科学探索的潜在影响--包括提供了解新分析物的途径，推进多组学分析技术，以及证明在人类健康和疾病研究中的重要应用。人体内的所有细胞都携带几乎相同的遗传信息。尽管这种共性存在，但在健康和疾病的背景之下，细胞类型和功能的生物多样性简直令人难以置信。这是因为不同类型的细胞有着独特的基因调控模式：基因组中的转录因子（TF）及其他调控元件以精确的方式相互作用，从而控制基因表达，在上调某些基因表达的同时下调其他基因的表达。即使是癌细胞也能从这些独特的基因调控模式中找到其来源，不过在发生癌变时，基因调控已经误入歧途，导致病理状况出现，而不是健康的细胞多样性。尽管这些调控机制是非常重要的，但定义TF结合诱导的基因组变化仍是一项重大的技术挑战。CRISPR技术被认为是一种可能的解决方案，可以通过扰动TF表达来确定其功能，然后追踪这对染色质可及性的影响。尽管可通过大规模筛选来获得一群细胞内TF扰动影响染色质可及性的平均读数，但基因调控具有高度的细胞类型特异性。例如，即使在同一肿瘤内，独特的基因调控模式也会驱动细胞异质性。这使得单细胞分辨率的CRISPR筛选成为一项重要能力，可在疾病或异质性样本的背景下了解基因调控。当然，这种方法也有其自身的挑战。虽然高通量的单细胞CRISPR筛选（点击阅读相关文章）能够更有效地扰动任何基因的功能，然后观察其对转录组的影响，但到目前为止，可提供相同的扰动效应读数的高通量CRISPR解决方案的开发还很有限，目前的方法仅限于每次分析96个细胞(1)。
这种技术方案上的鸿沟促使科学家团队开发出一种名为Spear-ATAC（使用scATAC-seq的单细胞扰动和可及性读数）的新方法，这个团队包括斯坦福大学的Sarah Pierce、Jeffrey Granja和William Greenleaf博士。新方法改善了10x Genomics的Chromium单细胞ATAC分析，能够捕获单链向导RNA（sgRNA）以读取CRISPR扰动，并在同一单细胞中分析扰动对染色质可及性的影响。通过这种方法，他们能够并行评估数千个单细胞中的数百个调控扰动，从而改变目前这类实验可获得的信息量和分辨率。阅读下文，了解这项技术背后的创新，以及他们如何使用它来了解癌症中的TF活性。Pierce等人在最近发表于《Nature Communications》的论文(1)中描述了这种新颖的CRISPR技术。Spear-ATAC与标准的单细胞ATAC-seq分析有着相同的起点，都是从离散的细胞核悬液开始。利用转座酶（Tn5）对这些细胞核进行处理，以便在基因组中的开放染色质区域进行切割。然而，在转座前如何用sgRNA转染细胞核，这种方法还存在分歧。为了确保该分析能够检测到sgRNA，无论其可及性背景如何（换句话说，无论Tn5在基因组的哪个位置进行切割），研究团队选择在每个慢病毒sgRNA的两端加上测序接头，以便用扩增ATAC-seq片段的引物来扩增与基因组DNA整合的sgRNA序列（图1, A）。按照标准的ATAC-seq流程，在Chromium仪器中运行单细胞核悬液，其中单个细胞核被包裹在油滴内，油滴内还包含带有独特寡核苷酸的凝胶珠。在这些GEM（Gel Beads-in-emulsion）中，细胞核的内含物（如ATAC-seq片段）被标上细胞核特异性的条形码，以便追踪片段的来源。同样，为了确保sgRNA在相同步骤中被检测到并与来源细胞核相关联，作者采用了特异性针对sgRNA骨架的反向寡核苷酸。这种寡核苷酸标记sgRNA，并且本身带有细胞核特异性的条形码，因此能够获得扰动读数及其对同一细胞核内染色质可及性的影响（图1, B）。作者随后对方案中的扩增循环数进行了一系列更改，并加入了生物素标记的引物来更加特异性地靶向sgRNA，从而进一步完善了实验方案（图1, C）。总的来说，与传统的慢病毒整合和单细胞ATAC-seq方案相比，这些实验创新让sgRNA的检测能力提高了40倍(1)。Spear-ATAC不仅填补了技术鸿沟，解决了在CRISPR筛选的背景下获取染色质可及性信息的生物学问题，在单细胞成本、时间和规模上也表现出明显的优势。例如，基于平板的方法可能需要多次迭代实验，花好几天才能评估几百个细胞核，而Spear-ATAC理论上只需要在10x Genomics的Chromium Controller上运行20分钟，一次就能回收多达80,000个细胞核(1)。图1. 基于Chromium Next GEM单细胞ATAC的改进型的Spear-ATAC工作流程的示意图。A) 在转座之前，用两端带有测序接头的sgRNA转染细胞核。B) 特异性针对sgRNA骨架的反向寡核苷酸确保sgRNA带有条形码，并与ATAC片段一起关联到来源细胞核。C) 额外的扩增步骤优化了sgRNA的检测。来源：基于10x Genomics产品说明《以单细胞分辨率分析染色质可及性》(LIT000039 - Rev E)，有修改。尽管这项技术的实验创新令人叹服，但技术如何转化成科学发现同样重要。关于转录因子的活性，Spear-ATAC可提供什么样的见解？为了解决这个问题，作者建立了一个sgRNA测试库，针对参与造血分化和发育的两个TF--GATA1和GATA2，以及非靶向对照，并将该文库引入表达CRISPRi dCas9-KRAB的K562白血病细胞中，以实现TF的敲除。利用Spear-ATAC的数据，他们开发出一个分析框架来鉴定携带不同sgRNA的白血病细胞中TF motif可及性的变化。这些分析带来了一些预期的结果：携带以GATA1为靶点的sgRNA的细胞表现出GATA1基因座的染色质可及性降低，表明这些细胞下调了该基因座的表达。然而，扰动对染色质可及性的影响又不仅仅限于基因组的这些特定区域。以GATA1为靶点的sgRNA与非靶向对照之间的可及性差异分析显示，在GATA1扰动后，总共有14,262个峰（14.76%）的可及性增加，而14,026个峰（14.52%）的可及性降低。可及性降低的峰对应于靠近红细胞特异性基因的基因组区域，而GATA1敲除后可及性增加的基因组区域靠近巨核细胞的特异性基因。这一发现表明，在K562白血病细胞中敲除GATA1可能会将细胞推向巨核细胞谱系。这不仅表明GATA1是造血分化过程中的一个重要因素，还可以解释为什么一些GATA1功能受损的遗传病患者会表现出红细胞生成的失调，且急性巨核细胞白血病的发病率增加(1)。这些创新方法尚处在开发的早期阶段，一些正在进行的实验揭示了Spear-ATAC的更大潜能。为了突破该方法的通量限制，斯坦福大学的团队随后建立了一个CRISPR文库来敲除白血病细胞中的36个转录因子，其中每个TF设计了2-3条靶向的sgRNA，还有14条对照非靶向sgRNA和12条靶向必需基因的sgRNA。在这个规模化实验中，他们从六个样本中捕获了32,832个细胞核，覆盖了128种不同的sgRNA基因型(1)。凭借实现多个不同扰动的高通量能力和高分辨率视图，研究团队设想了Spear-ATAC的多个令人兴奋的应用，包括生成TF的相互作用图谱，反映蛋白如何相互作用来调控非编码基因组，以及突变在疾病背景下如何影响TF的可及性motif。这些令人难以置信的技术创新，让复杂的生物学问题及其答案触手可及。创新的核心是将不可能变为可能；因此，在我们创新者系列不断增长的技术列表中，Spear-ATAC是一个非常有价值的代表。1. Pierce S, et al. High-throughput single-cell chromatin accessibility CRISPR screens enable unbiased identification of regulatory networks in cancer. Nat Commun 12: 2969 (2021). doi: 10.1038/s41467-021-23213
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