在当今社会,肺癌仍然位居全球肿瘤相关死亡的首位,其发病率以每年10%的速度稳步上升。肺腺癌(LUAD)是肺癌的主要类型之一。因此,迫切需要探索LUAD的增殖、转移和耐药机制。长基因间非蛋白编码RNA 518 (LINC00518) 被认为会在LUAD中引起癌症增殖和转移。尽管如此,LINC00518在LUAD中的准确作用和分子机制仍未确定。该研究发表于《Cell Death Discovery》,IF: 7.109。 为了筛选LUAD中潜在的致癌lncRNA,作者比较了从TCGA数据库下载的LUAD和正常组织中的lncRNA表达。火山图显示了来自TCGA的LUAD中所有差异表达的lncRNA(图1A)。然后作者使用COX和LASSO回归分析所有差异表达的lncRNA。LASSO回归的lambda模型如图1B所示。作者选择了最小的lambda,并选择了39个lncRNA(图1C)。接下来,作者检测了39个lncRNAs的表达,发现LINC00518在肺腺癌组织中的表达更高,使用GEPIA(http://gepia./)(图1E)。为了验证这一结论,作者分析了20个LUAD组织和癌旁组织样本中的LINC00518水平并发现了相同的结果(图1F)。作者分析了483名LINC00518高或低表达的LUAD患者的总生存期 (OS)、无病生存期 (DFS)、疾病特异性生存期 (DSS) 和无进展生存期 (PFS)。关于LUAD进展的集体结果表明,较差的预后与 LINC00518 的较高表达密切相关(图1D)。 通常有报道称,其他一些人类肿瘤的增殖是通过上游LINC00518控制的miRNA或mRNA来加剧的。为了探索哪些miRNA或mRNA在肺腺癌中同样起作用,软件Cytoscape (v3.6.0) 用于显示关于LINC00518的ceRNA相互关系的视觉网络(图1G)。令人惊讶的是,miR-335-3p与LINC00518有很强的相关性,在作者之前的研究中发现其相应的miRNA,miR-335-5p在LUAD中被下调。此外,许多研究预测miR-335-3p的靶基因是CTHRC1,该基因在LUAD中增加。通过这项工作验证如下,预测的ceRNA网络在LINC00518调节的 LUAD中显示极可能的miR-335-3p / CTHRC1轴。 肺腺癌细胞(A549和H1299)表达的LINC00518水平高于人支气管上皮细胞(BEAS-2B)(图2A)。在确定siRNA功效后,Cell Counting Kit-8测定和集落形成测定发现,与对照相比,LINC00518减少的细胞中的增殖显着降低(图2B,C)。接下来,作者可以使用伤口愈合和transwell检测来分别测量LINC00518对LUAD细胞迁移和侵袭的影响(图2D, E)。为了确定LINC00518敲低如何抑制LUAD细胞中的细胞增殖,作者通过Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) 4.1.0软件使用TCGA数据库进行了KEGG通路分析。结果表明,LINC00518可能对细胞周期和粘着斑至关重要(图2F)。然后,作者通过流式细胞术检测到LUAD细胞中S期细胞的比例有效降低,而G0/G1期细胞比例有效地增加(图2G)。 首先,在A549和H1299细胞中,作者检测了转染miR-335-3p的LINC00518的表达。使用qRT-PCR检测到LINC00518的水平与miR-335-3p的表达一致,在转染miR-335-3p模拟物的细胞中下调(图3A)。为了确保这一预测,作者接下来构建了含有野生型和突变型 miR-335-3p 结合位点的LINC00518荧光素酶质粒,如图3B所示。此外,RIP检测进一步验证了LINC00518和miR-335-3p之间的直接相互作用(图3C)。 作者通过使用模拟物诱导LUAD细胞中miR-335-3p的过表达,并通过CCK-8测定和集落形成测定研究了它们对细胞生长的影响(图3D, F)。为了确定miR-335-3p转染在 A549/H1299细胞中的作用,进行了伤口愈合试验和transwell试验,如图3E,G。 通过qRT-PCR测定,对应于miR-335-3p的CTHRC1水平在用miR-335-3p模拟物转染的细胞中下调(图3H)。为了确定这一预测,作者构建了CTHRC1野生型3'-UTR和CTHRC1 MUT 3'-UTR,并在A549和H1299细胞中进行了双荧光素酶报告基因测定(图3I)。 作者在A549和H1299细胞中建立了靶向CTHRC1的小干扰RNA (siRNA)。与具有低 CTHRC1表达的细胞相比,通过CCK-8和集落形成测定法测定的对照细胞的生长明显得到促进(图4A、B)。此外,CTHRC1的敲低抑制了A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力,通过伤口愈合和transwell测定显示(图4C,D)。流式细胞仪结果还表明,CTHRC1可以通过影响LUAD细胞的细胞周期来促进增殖(图4E)。 首先,从TCGA数据库下载LUAD中mRNA的表达数据,作者对CTHRC1和整合素的共表达进行了分析(图5A)。然后,将信息放入DAVID数据库(https://david./)进行功能分析,包括来自TCGA数据库的数据,之前进行的共表达分析,CTHRC1系数为0.3,P <0.05,和选定的基因。可以看出,CTHRC1可以聚集在细胞周期和粘着斑通路中(图5B)。为了确定CTHRC1是否可以影响整合素β3/FAK信号传导,作者使用了蛋白质印迹分析(图5C)。通过整合素β3和CTHRC1的共免疫沉淀可以揭示LUAD细胞的内源性整合素β3被CTHRC1抗体免疫沉淀(图5D)。然后作者使用H-Score来判断CTHRC1和整合素β3的表达。IHC染色结果显示它们在组织中的表达存在相关性(图5E)。 为进一步探索该研究的临床意义,作者检测了FAK抑制剂VS-6063在A549和H1299细胞中的IC50,结果表明miR-335-3p抑制剂可以提高VS-6063的IC50(图5G)。CCK-8测定还显示,具有VS-6063(5μmol/L)的细胞具有显着降低的增殖能力(图5F,H)。此外,作者使用Transwell分析表明,当miR-335-3p被抑制时,VS-6063可以抑制LUAD细胞的迁移和侵袭能力(图5I)。VS-6063的药物靶点FAK信号通过蛋白质印迹分析诱导(图5J)。 首先,使用异种移植小鼠模型来确认LINC00518在体内LUAD细胞中的作用。如图所示(图6A,B),由LINC00518敲低细胞形成的肿瘤在尺寸上明显小于由对比细胞形成的肿瘤。根据这些结果,发现LINC00518敲低的细胞中的肿瘤重量更轻(图6C)。接下来,作者从异种移植肿瘤中切除组织,并通过蛋白质印迹和qRT-PCR对其进行分析以验证 LINC00518和CTHRC1(图6D,E)。 用sh-LINC00518转染A549和H1299细胞会降低细胞增殖,同时抑制miR-335-3p会逆转这种作用(图7A)。此外,通过集落形成试验发现,LINC00518沉默细胞中的细胞存活能力显着降低,而这种对细胞存活的负面印象可以通过miR-335-3p的低表达来逆转(图7B)。此外,Transwell分析表明,LINC00518 与调节LUAD细胞的侵袭和迁移有关,miR-335-3p 抑制剂逆转了LINC00518敲低诱导的迁移和侵袭抑制(图7C)。流式细胞术结果还表明,敲低LINC00518对A549和H1299细胞的细胞周期的影响可以被miR-335-3p抑制剂逆转(图7D)。通过蛋白质印迹证实,敲除A549和H1299细胞中LINC00518的表达降低了CTHRC1 的蛋白质水平,而miR-335-3p抑制剂逆转了这种作用(图7E)。这种搜索的示意图如图8所示。 该研究阐明了LUAD中细胞质lncRNA LINC00518的临床意义和生物学功能。LINC00518作为调节CTHRC1的分子海绵,通过整合素介导的粘着斑信号促进LUAD生长和迁移。此外,LUAD样本中LINC00518的表达高于正常,LINC00518的表达是LUAD患者预后的指标。LINC00518 /miR-335-3p /CTHRC1轴可能会拓宽FAK抑制剂VS-6063在 LUAD中的应用。该研究结果表明,LINC00518可以作为LUAD中FAK抑制剂的预后和协同治疗靶点的有前途的生物标志物。 生信分析:TCGA数据库分析,KEGG通路分析,DAVID数据库功能分析 常规分子实验:qRT-PCR,质粒构建,RIP检测,蛋白质印迹分析,免疫共沉淀,western blotting,双荧光素酶报告基因检测 细胞实验:CCK8细胞增殖,transwell试验细胞迁移和侵袭,流式细胞术细胞周期,划痕实验,集落形成 动物模型与病理检测:异种移植小鼠模型,IHC染色 |
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