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作者：刘亚洲,邢蕊蕊,闫学海..高分子学报,2022,53(10):1173-1186光热治疗与免疫治疗功能上的互补以及协同效应使得光热免疫治疗在抑制实体瘤及转移瘤方面具有非常优异的表现，然而当前使用的光热免疫制剂的局限性限制了其临床应用转化，对于这种复合疗法的开发和优化已经成为肿瘤治疗领域的研究热点. 其中，基于寡肽分子设计的功能组装体获得了越来越多的关注，这类组装体不仅可以通过氨基酸编码设计组装结构，而且可以通过生物活性肽的引入实现优异的抗肿瘤治疗性能. 本专论中将根据寡肽分子参与抗肿瘤体系构建的不同作用，结合本团队的研究进展，对近期寡肽组装体在肿瘤光热免疫治疗的研究进行总结. 首先探讨了寡肽参与光热免疫体系组装调控的思路，阐述了组装调控过程中寡肽在强化体系稳定性、优化光热转化效率及诱导免疫应答的机理. 此外，还结合国内外研究现状，对不同功能肽在肿瘤光热免疫治疗中的作用进行了总结，并分析了寡肽组装体在肿瘤治疗领域的应用前景，最后对该领域的发展方向进行了展望.近年来，随着对人体免疫学认识的加深，免疫治疗相关技术及药物的研发得到了快速发展，临床上优良的表现使得免疫疗法已经成为一种重要的癌症治疗策略. 免疫疗法是利用人体自身免疫系统的特异性来增强对肿瘤细胞的自然防御，其在应对癌症的转移及复发难题上具有其他癌症治疗方法(如手术、放疗、化疗)无可比拟的优势[1,2]. 然而，由于免疫疗法不是直接杀伤肿瘤细胞，而是通过活化免疫细胞进而发挥其抗癌功能，这导致其对具有免疫抑制微环境的原发实体瘤的治疗效果普遍不佳，所以临床上通常需要将其与其他强力的治疗方法联合使用[3~6].光热治疗是一种可对病灶部位进行局部热处理的治疗方式，其利用光热制剂捕获具有特定能量的光子经由非辐射跃迁将能量转化为热能，这种无创、精准、安全的疾病治疗方式近年来得到了广泛的应用[7~9]. 同时，光热治疗作为一种优异的免疫开启方式，其诱导的烧蚀作用可引起肿瘤细胞发生免疫原性死亡(ICD)[10~12]. 此过程中释放的肿瘤相关抗原(TAAs)及损伤相关分子模式(DAMPs)能够刺激机体产生免疫应答，从而实现对免疫治疗的促进作用[13,14]. 因此，将光热治疗与免疫治疗有机结合，不但能实现对原发瘤的高效清除，还能通过对免疫系统的激活与调控抑制肿瘤的转移及复发，实现对治疗效果的促进作用. 这种功能互补、性能协同的癌症联合疗法能够展现出高效、持久的肿瘤抑制作用，可显著改善恶性肿瘤进程，延长癌症患者的生存期.分子自组装是超分子化学中构建功能超分子体系的重要手段，其利用2个或2个以上构筑基元之间的分子间弱相互作用(包括氢键、静电作用、π-π堆积作用、疏水作用、配位作用等)形成规则有序的结构，从而实现对特定功能材料的制备[15~18]. 超分子自组装独有的性质使其非常适合光热免疫治疗体系的构筑，如：组装基元自身具有抗肿瘤功能，形成超分子体系后能够高效地进行肿瘤递送，从而提高抗肿瘤效率[19,20]；组装基元之间紧密的联系能够实现对彼此功能的调控，这为改善光热制剂的光热转化效率提供了基础[21]；组装基元之间主要为非共价作用，这种弱相互作用连接而成的超分子组装体是动态的，其能够针对外部环境的变化产生响应性的行为，如解体、变形等，这为构建刺激响应型组装体提供了一种思路[22,23]；此外，这种非共价键的构筑策略在维持免疫功能分子的活性方面具有先天性的优势[24,25]. 寡肽作为一类由不超过10个氨基酸构成的活性小分子，其可被生命体中的多种生物酶所降解，具有极低的免疫原性. 同时，寡肽清晰明确的代谢机制保证了它们在生物医药应用领域的安全性[26,27]. 另外，寡肽分子结构的多样性赋予了其丰富的组装位点，功能的多样性使其能够满足各种抗癌体系的设计需求，寡肽分子的这些性质使其成为一种理想的组装基元[28~30]. 近年来，基于寡肽构筑的超分子组装体并将其用于肿瘤的光热免疫治疗的报道已经广泛出现. 在本专论中，我们将根据寡肽分子参与抗肿瘤体系构建的不同作用(如图1所示)，对近期寡肽组装体在肿瘤光热免疫治疗的研究进行总结.目前人类已经发现22种天然氨基酸，它们的物理性质(极性、熔点等)和化学性质(等电点、化学基团等)各不相同. 氨基酸种类以及序列的差异赋予肽多样的组装行为，不同种类的肽分子(寡肽、多肽、聚肽等)参与至超分子组装体系的构建能够有效地改变组装基元的物化性质，增强组装体的结构以及功能稳定性[31~33]，强化体系的光热和免疫治疗效果[34,35].大量参与抗肿瘤体系构建的功能组分为疏水性的分子，尤其是一些色素类的光热制剂，它们非水溶以及无靶向的性质致使其生理稳定性较差，难以发挥其生物功能. 此外，这些光热色素的化学稳定性通常较差，在光热转化过程中，快速升高的环境温度致使其极易被氧化[36]. 精心设计的两亲性分子能够通过多种非共价作用调控非水溶功能分子的物化性质，形成的组装体能够有效地改善体系的生理稳定性. 另外，参与超分子组装的大部分光热色素分子被困在与环境或溶剂隔离的组装体中，这种隔离能够有效地保护光热剂分子免受氧化或分解，从而维持其光物理及光化学性质[37]. 因此，超分子组装策略对于增强光热治疗体系的生理稳定性以及光稳定性具有重要意义.寡肽分子不但具有优异的生物相容性，而且其结构可调及功能多样的性质能够满足不同组装体系的稳定性调控需求，这些性质使得寡肽被广泛地应用于各种光热组装体系的设计中. 然而寡肽作为一种小分子，其生理稳定性较差，这导致其在血液或体液递送过程中极易被各种生物酶分解，限制了它的生物利用效率. 寡肽参与的超分子组装能够同时改善光热色素及寡肽自身的生理稳定性，这种两者之间互相保护的载药策略能够有效地提升药物的利用率[6,29]. 例如：我们利用含组氨酸的寡肽(ZHO)与内源性光热色素(胆绿素，BV)的组装行为，制备了一种安全、稳定的光热组装制剂，并详细地研究了其在癌症诊疗方面的应用(图2)[38]. 其中，BV作为一种内源性的色素分子，具有出色的生物相容性. 其对600~900 nm近红外光的强烈吸收使其成为一种优秀的光热剂，但是它也面临着疏水性导致的生理环境不稳定难题. 经由Mn2+配位作用的稳定保护，两亲性寡肽ZHO能够通过疏水及π-π堆积作用与BV进行超分子自组装，得到一种粒径约为120 nm的光热组装制剂(ZBMn NPs). 这种可在生理环境下稳定存在的组装体延长了光热制剂在生物体内的半衰期，具有良好的光稳定性，展现出优于单一光热色素(BV)的癌症治疗效果，证明利用寡肽分子调节光热制剂自组装，从而强化抗癌制剂的稳定性对于促进光热治疗是可行的。 
由于组装体中组装基元之间的紧密联系，精密设计的肽分子除能够稳定组装体外，还可能会对邻近光热分子的光物理性质进行调控，这为优化光热制剂的光热治疗效率提供了可能 . 基于此，我们提出“超分子光热效应”的新机制，并进行了一系列的探索工作[39,40]. 比如，缀合二肽的光敏剂组装单元(TPP-G-FF)可通过超分子自组装过程形成一种可进行光热转化的纳米点(PPPNDs)[41]. TPP作为一种常用的光敏剂，被广泛地应用于各类光动力治疗体系中. 在这项工作里，我们利用TPP自聚集的特性，使用精密设计的寡肽分子对其聚集结构进行调控，增强光敏剂分子非辐射跃迁的几率从而促进光热治疗，如图3(a)和3(b)所示. 其机理为二肽可对色素分子组装形成的J-聚集体进行调控，降低了受激电子发生辐射跃迁以及系间跨越的几率，从而保证更多的能量以非辐射跃迁的形式(热能)被释放出去，进而实现高效的光热治疗. 该卟啉基纳米点的光热转换效率可达54.2%，优于许多广泛应用的无机材料. 这种具有高光热转化效率的纳米点能够有效地增强光热治疗效果、降低光辐射损伤.
为构建活性可控的超分子光热组装制剂，我们使用氨基酸编码技术详细研究了不同寡肽分子对光敏色素光热治疗效率的调控，如图3(c)和3(d)所示[42]. 研究发现氨基酸编码的寡肽(包括D，DD，DDDD，FF，YY)与光敏色素(焦脱镁叶绿酸A，PheoA)构筑的纳米组装体不但具有不同的细胞内化和分解行为，而且它们的光热转换效率也存在一定的差异，于是可通过操纵氨基酸序列和类型对寡肽光热组装体的结构、光热转换效率和治疗性能进行调控. 这种结构可编程、性能可定制的纳米光热组装制剂对于实现个性化、精准化癌症治疗具有重要意义，在生物医学应用中具有广阔的应用前景.光热治疗作为一种有效的癌症治疗方式，其与免疫疗法的联合使用能够实现2种疗法之间的功能互补及协同促进. 但是光热制剂与免疫制剂的临床应用仍存在众多问题，如稳定性不佳、光热转化效率低、免疫制剂诱导的免疫响应不足等. 寡肽参与形成的光热免疫组装体，不仅能够增强体系的稳定性，通过超分子光热效应促进光热治疗效果，而且可以显著改善机体对免疫制剂的代谢及摄取行为，协调TAAs的递呈，优化免疫治疗效果. 最近，我们利用具有优异生物相容性的胶原肽(collagen)及海藻酸盐(alginate)作为水凝胶构筑基元对光热色素(亚甲基蓝，MB)及免疫佐剂(咪喹莫特，R837)的抗癌性能进行调控(图4)[43]. 实验证实这种可注射的混合水凝胶(GelMb-R837)具有良好的剪切变稀和自愈合性质，适用于抗癌药物的局部递送和延时释放；精确的调控使得体系中的光热色素拥有良好的光热转化效率，能够对原发肿瘤进行高效的光热消融；此外，光热治疗产生的 TAAs 及 DAMPs 能够联合Toll样受体激动剂R837促进机体产生免疫应答，实现对远端转移瘤的抑制. 这种安全无毒、性能优异的肽基水凝胶展现出了高效的光热免疫治疗效果.
寡肽在组装体系中除可作为组装基元参与组装体的形成外，其作为生物活性分子，精密设计的氨基酸序列将赋予肽不同的功能. 在抗癌药物体系设计中，这些生物活性肽能够有效地增强药物制剂在体内的富集，可控地完成药物的释放，参与免疫通路激活进而促进免疫响应[51,52].活性肽的这些性质对于促进药物的抗癌性能以及降低对正常组织的副作用具有重要意义. 按照活性肽生物功能的不同，我们将它们分为3类：靶向肽、肿瘤微环境响应肽、治疗肽，接下来将详细阐述它们在光热免疫组装体系中的应用进展.赋予抗癌药物主动靶向的性能是促进药物积累的先进策略. 随着肽筛选技术的发展，如噬菌体展示，大量具有肿瘤归巢能力的寡肽分子已被发现，这些活性肽可以特异性地与肿瘤组织中特异性表达或过表达的各种受体结合[53]，如表1所示. 与抗体相比，靶向肽的合成成本更低，而且体积也要小得多，这使得它们在组织渗透方面更有优势. 与其他小分子靶向制剂相比，寡肽在分子设计上更加直接，生物相容性更高. 这些性能上的优越性使得靶向肽已被应用到了光热免疫治疗体系的设计中.
Zhan等将靶向环肽(cRGD)连接至修饰有近红外光热制剂(CS)的高分子共聚物 P(DMA-co-CSMA)一端，随后调控两亲性高分子与疏水免疫佐剂(瑞喹莫特，R848)之间的相互作用，通过超分子自组装过程构建了一种聚合物纳米颗粒(R848@cRGD-PDCS)，并将其用于癌症的光热免疫治疗(图5)[44]. R848@cRGD-PDCS纳米颗粒中的靶向环肽能够与肿瘤新生血管表面高表达的整合素αvβ3结合，实现纳米药物在机体内的主动靶向递送，促进药物在病灶部位的高效富集. 此外，CS作为一种高度亲脂性的阳离子罗丹明衍生物，能够穿越线粒体膜并在带负电荷的线粒体膜中进行积累. 这种双靶向的纳米颗粒能够在温和光热治疗(41~43 ℃)作用下诱导原发瘤线粒体损伤，释放的TAAs联合免疫佐剂R848激活免疫响应，从而实现了高效的光热免疫协同治疗.
另外，Yang 等设计了一种类似的纳米组装体(GOP@aPD1)，并将其用于实现对黑色素瘤的光热免疫治疗[45]. 该纳米药物利用另一种靶向肽(GRGDS)与黑色素瘤细胞膜表面高表达的整合素α5β3结合，实现了高效的药物递送. 光热治疗产生的TAAs能够与Anti-PD1抗体联合作用，实现光热治疗与免疫检查点阻断治疗的协同抗癌功能.肿瘤细胞异常旺盛的新陈代谢致使其呈现出与正常细胞截然不同的微环境特征，包括低pH、异常表达的生物分子(如活性氧簇、GSH、各种生物酶)等. 肿瘤微环境响应肽可在肿瘤微环境的特征因子刺激下发生断裂、变形、结合等响应性行为. 响应肽在实现药物的可控释放，促进药物在病灶部位的富集，改善肿瘤细胞对药物的摄取等方面具有优异的表现. 它能够显著地提高药物制剂的抗癌功能，降低副作用，已被广泛地应用于各类抗癌药物体系的设计中，如表2所示. 例如：低pH插入肽(pHLIP)可在肿瘤酸性微环境中发生扭曲，形成α-螺旋结构并嵌入至肿瘤细胞膜内，从而实现药物在肿瘤部位的富集[54,55]. 此外，我们利用阳离子聚肽(PLL)与阴离子蛋白质(HSA)之间的静电作用构建了一种球形组装体，其可在多重肿瘤微环境特征因子(低 pH、GSH 及蛋白酶)作用下对载荷进行释放[56]. 肿瘤微环境响应肽能够精准地实现药物在病灶部位的富集或释放，可显著地抑制药物在递送过程中的泄露，保证了高效的抗肿瘤功能.
光热免疫治疗体系中免疫药物对正常组织或器官引发的免疫损伤是制约它们临床应用的关键因素之一，而将肿瘤微环境响应肽整合至体系的设计中将有望解决这一难题. 其中，如图6所示，Ma 等利用响应肽(Pep，PVGLIG)连接聚乙二醇(PEG)以及免疫调节药物(艾卡哚司他，IDOi)，形成的两亲性高分子mPEG-Pep-IDOi与疏水光热染料ICG经由超分子自组装过程构建了一种肿瘤微环境响应的前药平台(mPEG-Pep-IDOi/ICG)[59].肿瘤微环境过表达的基质金属蛋白酶(MMP)会特异性地对响应肽进行切割并导致PEG外壳的脱离，失去外壳保护的内部药物会以较小粒径的组装体形式释放出来，从而促进肿瘤细胞对药物的摄取. IDOi是一种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，能够有效地抑制色氨酸的降解，扭转树突状细胞对T细胞的抑制，促进T细胞的增殖. 最后，IDOi活化的T细胞对光热治疗产生的TAAs进行分析处理，实现对机体免疫响应的激活. 此外，这种前药平台还能与免疫检查点阻断药物联合使用，展现了较好的临床应用前景.
除了靶向肽和肿瘤微环境响应肽外，还有一类本身就具有抗癌功能的寡肽分子，我们将它们称之为治疗肽. 治疗肽通常来源于趋化因子、细胞外基质蛋白、生长因子、抗原以及其他蛋白.它们能够选择性地靶向特定受体，从而激活重要的信号通路或抑制受体与其配体的相互作用，最终达到抗肿瘤的目的[61]. 目前，已有大量的治疗寡肽被发现，并广泛地应用于抗肿瘤体系设计中，对它们的筛选与研究进一步拓展了肽在生物医学领域的应用，如表3所示.
传统的治疗肽是一些可直接诱导肿瘤细胞凋亡的肽分子，如酪丝亮肽(YSL)能通过下调B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)以及细胞周期蛋白D1的表达，诱导肿瘤细胞凋亡. 一些报道利用它们与光热制剂构建超分子组装制剂实现了高效的抗肿瘤目标[62]. 对于免疫治疗而言，体系设计中常采用的为免疫活性肽. 相较于传统免疫调节药物，免疫活性肽拥有更多的优势，如：生物安全性高、合成方法简单、免疫调节功能多样等. 这些优势使得免疫活性肽得到了广大研究工作者的注意，大量的免疫活性肽得到开发，其中一些基于免疫活性肽的药物已经通过临床验证，并被应用到了实际癌症预防及治疗中，如基于WT1抗原肽的疫苗Galinpepimut-S已于2018年被美国食品与药物管理局(FDA)批准[63].虽然免疫活性肽具有以上提及的各种优势，但是其仍面临单一免疫制剂诱导免疫响应不足的障碍. 将其整合至光热免疫体系设计中，光热治疗产生的 TAAs 及 DAMPs 将有助于强化免疫活性肽的免疫调节功能，进而刺激机体产生免疫应答. 其中，Sun等利用卵清蛋白(OVA)作为抗原肽，与光热剂ICG自组装得到了一种光热免疫制剂，展现了良好的光热免疫协同效应[64]. 此外，我们发展了一种寡肽调控自组装的策略：利用免疫活性肽(胸腺五肽，TP5)与ICG之间的氢键等多重作用构建了一种光热免疫纳米纤维(图7)[65].该制剂的组装基元(TP5与ICG)均为FDA批准的临床成分，它们的生物安全性得到了大量临床试验的验证. 而且相对于单一光热制剂ICG，组装体TP5-ICG的光稳定性以及光热转化效率均得到了显著的提升，从而强化了对肿瘤的光热治疗效果. 此外，TP5作为一种免疫调节肽，其能够通过促进胸腺发育及诱导B细胞分化强化机体的免疫功能. 光热治疗产生的TAAs协同免疫调节肽TP5 能够高效地诱导抗肿瘤免疫细胞成熟及分化，实现对远端转移瘤的有效抑制. 这种利用被批准药物进行组装体设计的策略能够保证药物在生物医药利用过程中的安全性以及功效性，该策略制备的药物有望直接进行临床应用研究.
另外，Qian 等将靶向肽、响应肽以及治疗肽整合至一条多肽链段(CF27)中，响应性连接剂(BISS)可与CF27的巯基通过迈克尔加成反应形成自交联网状结构的纳米颗粒[48]. 随后，疏水光热制剂(IR820)及化疗药物(多烯紫杉醇，DTX)嵌入至纳米网络颗粒并进一步稳定组装体系，最终制备了一种粒径均一、结构及功能稳定的纳米组装体(DTX-IR820-CF27). 如图 8 所示，这种组装体可通过靶向肽(Lyp-1)与肿瘤血管内皮细胞表达的p32受体蛋白结合实现主动靶向，并在肿瘤微环境中过度表达的MMP及GSH作用下诱导连接交联网络的响应肽(PLGVRG)及连接剂(BISS)发生断裂，从而导致纳米结构的坍塌. 纳米组装颗粒的解体不但能够促进药物与深层的肿瘤接触并发挥作用，而且还会暴露负载的化疗及光热药物，进而诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡. 产生的 TAAs 会协同 CF27 残留的免疫检查靶点阻断肽(NYSKPTDRQYHF)共同诱导激活T细胞，促进免疫响应. 此外，构成免疫检查点阻断肽序列中的氨基酸全部为D型氨基酸，这能够有效地抑制药物肽被生理环境中的酶水解，强化其在机体内的稳定性，展现出了良好的光热免疫协同疗效.
本文从寡肽分子参与形成抗肿瘤超分子体系中的不同作用着手，系统总结了寡肽组装体的功能调控和光热免疫治疗应用进展. 这种联合了光热和免疫协同效应的肿瘤治疗方式，展现出其功能的全面性以及有效性，具有优异的临床应用价值. 其中，光热治疗通过热消融作用对原发实体瘤进行清除，而免疫治疗能够促进机体产生持久的免疫记忆以应对肿瘤的转移及复发，它们功能上的协同以及互补效应为高效的抗肿瘤性能提供了保障. 天然氨基酸构成的寡肽具有较低的免疫性以及清晰明确的代谢通路，优异的生物相容性使其在医药应用上生物安全性方面的顾虑较低.以寡肽为基元构筑光热免疫组装体，不但能够有效地调节组装体在机体内的稳定性、循环代谢等行为，而且寡肽分子功能的多样性使其能够满足不同体系的设计需求，可在靶向输送、病灶富集、免疫增强等方面发挥功能，提升癌症的治疗效果.虽然寡肽组装体在肿瘤光热免疫治疗方面具有较大的优势，并且在动物实验中取得了重要进展，但是其在临床转化中仍面临诸多挑战. 在后续研究中，建议从以下几个方面开展更加深入、系统的工作. 首先，激光穿透性不足仍是光热治疗临床应用的重点关切. 自组装基元之间组织模式能够对光热制剂的能级跃迁产生影响，这为调控光热制剂的吸收提供了可能[70~72]. 基于此，可对参与组装的寡肽分子进行精确设计，调节光热色素分子的堆叠方式产生J-聚集体，这将可能导致体系的吸收发生较大红移. 其次，由于难以控制光热制剂引发的热烧蚀作用，这导致病灶部位过度升高的温度在清除肿瘤组织的同时，难免会对肿瘤周边正常组织造成损伤. 为了保证高效的光热免疫治疗效果，在光热治疗过程中精确地控制光热效应引起的温度变化是必要的. 再者，目前使用的免疫制剂的免疫活性仍普遍较低，产生的免疫响应在不同患者个体中存在较大的差异，降低了光热免疫治疗的普适性. 开发具有高免疫活性的制剂(特别是免疫活性肽)以及多种免疫制剂的联合使用将有望促进机体产生更有效的免疫应答，这对于优化组装体药物的临床表现具有重要意义. 另外，寡肽在医疗保健方面的滥用已呈现出快速蔓延的趋势，虽然其拥有优异的生物相容性，但是它们的过量以及不恰当使用可能会刺激机体产生不良反应，如过敏、皮肤红肿等，对于寡肽应用剂量的筛选仍需要大量临床数据的支撑. 最后，目前报道的体系仍普遍处于概念和模型阶段，尚需进一步开发简单、高效、通用的光热免疫组装体，并在临床研究中验证体系的生物安全性以及有效性.免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可联系删除
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