【原】对CD8+ Ts细胞的研究获得资助的情况越来越少，人们对这些细胞的兴趣也逐渐消失，尽管它们从未完全消失。

CD8+ suppressor T cells resurrected.   

Judith A Kapp, R Pat Bucy

Human immunology. 2008 Nov; 69 (11) :715-20. doi:10.1016/j.humimm.2008.07.018

PMID:18817830

这篇综述的重点是介导免疫应答主动抑制的抗原特异性T细胞在过去35年中所起的作用。这一领域经历了几个关于这种抑制性/调节性T细胞的公认范式的变化，从最初的迹象表明这种细胞是CD8 +的，到认为这种细胞不存在，再到鉴定转录因子Foxp3是抑制功能的关键协调者。虽然静息状态下大多数Foxp3 +细胞是CD4 +CD25 +细胞，但外周抗原可通过选择性细胞因子条件(尤其是TGF-β)诱导Foxp3的表达和抑制功能。这种被诱导的T细胞出现在CD4和CD8+ T细胞谱系内，并似乎通过抑制抗原呈递细胞的共刺激活性和抑制性细胞因子的产生来介导抑制。在胸腺发育过程中，不能选择许多Foxp3阳性细胞的TCR Tg T细胞的最新数据被综述，强调"连锁抑制"的模式和不同抑制机制的相对效能的重点。

//虽然诱导免疫耐受最早于1911年[1]被描述，但直到Gershon证明免疫耐受可以通过T细胞[2]转移到初始受体，人们才认识到免疫耐受可以积极维持的事实。Gershon将这种形式的抗原特异性耐受称为“感染性耐受”，过继性转移耐受的T细胞称为“抑制性”T细胞，以区别于辅助性T细胞[3]。抑制性T (Ts)2细胞后来被鉴定为ly2,3 (CD8) T淋巴细胞[4,5]。这些观察结果促使我们测试抑制性T细胞是否在与主要组织相容性复合体(MHC)ⅱ类基因的某些等位基因表达相关的无应答中发挥了作用。我们的结果表明，对合成多肽和胰岛素的无反应是由CD8+ T细胞主导的，它们抑制CD4辅助性T细胞的功能[6,7]，而CD4+辅助性T细胞在胰岛素的情况下与自身抗原发生交叉反应[8,9]。抗原特异性CD8+ T细胞过继转移耐受的能力已被许多其他研究者使用各种实验系统证实(见[10,11])。在20世纪70年代和80年代初发表了大量关于CD8+ T细胞特征的研究之后，几个发现的集合导致了该领域在80年代中后期的消亡。首先，在产生其他T细胞的长期细胞系和克隆方面非常有用的方法只产生了很少的具有抗原特异性抑制活性的稳定CD8+ T细胞。其次，当MHC被测序为[12]时，没有对应于Ts细胞相关血清学决定簇(称为I-J)的编码区，并且没有来自Ts细胞杂交瘤的mRNA转录物杂交到跨越MHC[13]的I-A和I-E亚区cosmid克隆。第三，从Ts细胞中提取或由Ts杂交瘤细胞加工的可溶性抑制因子的生化性质，尽管几个实验室进行了艰苦的努力，但仍未阐明。第四，可能也是最关键的一点是，免疫学研究的重点转向了免疫应答关键要素的分子鉴定。在分子水平识别免疫调节机制的能力吸引了许多研究者放弃对与Ts场相关的复杂细胞“回路”和定义不清的“因素”的研究。遗憾的是，抗原特异性T细胞可能具有专门抑制功能的整个概念与I-J+ CD8+ Ts一起被抛弃。随着这一观点成为主流，对CD8+ Ts细胞的研究获得资助的情况越来越少，人们对这些细胞的兴趣也逐渐消失，尽管它们从未完全消失。

T细胞可积极维持耐受这一观点的重新兴起可追溯到一长系列研究，这些研究始于观察到新生儿胸腺切除术导致了卵巢炎[14]的发生，随后确定卵巢炎是一种自身免疫性疾病[15]。胸腺切除术诱导的自身免疫性卵巢炎由抗原特异性T细胞介导，CD4+ T细胞[16]可抑制。抗原是自身耐受(Samy et al.[17]综述)形成和CD4+ T细胞的抑制功能所必需的[18,19]。介导这种效应的未免疫CD4+ T细胞表达CD25是关键的，因为它允许它们与其他CD4+ T细胞在物理上分离，并被证明是自身耐受[20]的介质。为了避免与抑制性T细胞的负面含义，CD4+ CD25+ T细胞后来被称为调节性T (Treg)细胞，这是一个不幸的名称选择，因为根据定义，“调节”既包含积极作用，也包含消极作用。

虽然CD25有助于识别Treg，但它并不是唯一的Treg标记，因为所有活化的T细胞都表达CD25。然而，目前尚未发现其他细胞表面抗原可作为Treg细胞(或CD8+ Ts细胞)独有表达的谱系标志物。然而Foxp3[21,22]已被确定为驱动初始T细胞分化为Treg谱系并维持其抑制功能的主开关[22-24]。抗Foxp3抗体可以鉴定出Treg细胞，但构建Foxp3报告基因(Foxp3gfp)小鼠可以通过流式细胞术物理分选出存活的Treg细胞。使用标准Treg检测，产生的GFP+，而不是GFP-, T细胞负责CD4+ CD25+细胞亚群的调节活性[25-27]。

尽管有证据表明Treg细胞通过识别自身抗原来阻断自身免疫，但很难确定这些T细胞识别的表位库或建立用于功能研究的克隆系。另一种方法是观察到表达Foxp3的Treg细胞[28,29]可以通过耐受性途径用外源性抗原刺激CD4+ CD25- T细胞[30,31]，或者在TGF-β存在的情况下通过体外活化诱导[28,32]。因此，使用T细胞受体(TCR)转基因(Tg) T细胞来研究Treg的特异性和作用机制是可能的(综述在[33])。综上所述，这些结果表明，如果不是全部，大多数初始CD4+ T细胞在适当的条件下被激活，可能有能力成为Treg细胞。如果这一假设是正确的，那么初始Treg和诱导Treg之间稳定性的差异可能反映了体内自身抗原慢性刺激和外源性抗原急性激活引起的Foxp3表达的固化。最近的一项研究证实，Foxp3基因的稳定表达与一个保守的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)富集元件的去甲基化和Foxp3基因座的染色质修饰相关，从而产生一个永久性的抑制细胞系[34]。因此，甲基化抑制剂诱导Foxp3表达，增强CD4+细胞的抑制活性[34,35]。

将TCR Tg小鼠与Foxp3gfp报告小鼠杂交后，我们证明了在TGF-β和IL-2[36]存在的情况下，CD4 Foxp3 TCR Tg T细胞可以被抗原激活诱导。这些研究也证实了这种抑制活性是GFP+而不是GFP-转化生长因子(TGF)激活的T细胞的功能。所述诱导的TCR Tg Treg在抑制初始T细胞[36]的增殖和效应反应的能力方面与天然Treg相似。更重要的是，使用TCR Tg小鼠作为Treg细胞的来源使我们能够研究其抑制活性的抗原特异性(图1)。抑制对于诱导抗原具有特异性，因为即使在表达Treg或效应T细胞表位的抗原提呈细胞(APC)混合刺激下，对无关抗原的特异性T细胞产生的应答也未受到Treg的抑制。因此，在测试的培养条件下，没有旁观者抑制的证据。而Foxp3 T细胞在APC[36]同时表达Treg和效应表位的情况下，能够抑制T细胞对无关抗原的特异性反应。这种现象最初被Holan和Mitchison[37]称为“连锁抑制”，并在多个实验系统中反复验证[38-40]。因此，Tregs在体外活化和效应功能上都具有特异性，这与有数据表明Tregs在体内具有精细的功能特异性相关[17,18,40,41]。多克隆天然Treg是否表现出连锁抑制是一个重要的问题，但这是一个实验问题，因为APC可能表达多种自身抗原。因此，暴露于外源性抗原的表达自身抗原的APC可能与自身反应性Treg和外源性表位特异性效应T细胞相互作用，这可能被误解为非特异性抑制。Treg和应答T细胞必须识别相同的APC，这一观察结果从机制上解释了Treg必须与效应T细胞直接接触才能抑制其应答这一常被报道但却知之甚少的要求。正如辅助性T细胞[42]所示，Treg和初始应答T细胞是在APC起始簇的范围内直接相互作用，还是两个T细胞与相同的APC依次相互作用(图2)，目前尚不清楚。然而，Tang等人的精确原位研究表明，Treg与APC相互作用，而与其他T细胞不相互作用，这减少了CD4+效应T细胞与APC[43]相互作用的时间。

CD8+ Ts细胞在TGF-β存在时可被抗原激活，这在一定程度上再次引起了人们对CD8+ Ts细胞作用的关注[44,45]。最近，在无排斥反应的人类心脏移植受者的血液中也发现了抗原特异性CD8+ Ts细胞[46,47]。我们对确定CD8+ T细胞延长同种异体移植物存活时间的机制很感兴趣，但对同种异体抗原特异性排斥反应的调节很难分析。造成这一困难的原因有以下几个:(1)天然同种抗原的复杂性;(2)大量表达异质受体的T细胞能够识别宿主和供体动物之间有限的同种抗原差异;(3)多种类型的APC通过多种途径提呈抗原。应用与研究CD4+调节性T细胞相同的还原论方法，我们将卵清蛋白(OVA)特异性Rag1-/- TCR Tg OT1小鼠[48]的CD8+ Ts细胞与表达鸡OVA转基因[49]小鼠的脾细胞(作为APC来源，伴或不伴外源性TGF-β)共同孵育。我们使用B6 T细胞或TCR Tg小鼠的T细胞(TCR75)，以C57BL/6 (B6)背景[50]上的I-Ab II类分子(Kd54-68/I-Ab)提呈的H-2Kd MHC I类分子衍生的单肽特异性检测抑制作用。从表达H-2Kd (B6. kd)[51]、鸡卵蛋白基因(B6.OVA)或两者基因(B6. kd .OVA)的转基因B6小鼠中获得APC和心脏。我们的结果表明，来自TCR转基因OT1小鼠的CD8+ T细胞不表达内源性的Foxp3+ TCR Tg T细胞[52]，这与观察到只有极少数自然产生的具有Treg表型的CD8+ T细胞是一致的[25,53]。用B6刺激OT1 T细胞。OVA APC诱导T细胞具有裂解活性，表达颗粒酶B和IFN-γ，但不表达Foxp3。在TGF-β的作用下，B6.OVA APC诱导的T细胞表达颗粒酶B、INF-γ和裂解活性较无外源性TGF-β激活的细胞低，但表达Foxp3的细胞明显增多。OT1 T细胞在有或没有TGF的情况下都表现出抑制活性，但被TGF激活的细胞活性高[52]许多倍。这些结果支持由OVA脉冲的APC激活的OT1 T细胞，经TGF-β处理后，抑制了OVA特异性的迟发性超敏反应[54]。此外，活化的OT1 T细胞在混合的APC刺激下不能抑制对无关抗原的应答，每个抗原仅表达一个抗原表位。然而，当APC同时表达Ts和效应T细胞表位(如上文对CD4+ TCR75 Treg所述)时，TGF-β活化的OT1 T细胞表现出连锁抑制(图1)。

多种机制可以解释CD8+ Ts细胞对APC的集中抑制。首先，活化的CD8+ Ts细胞可以通过传统的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)机制直接杀伤APC细胞，APC细胞数量的减少会导致后续应答的降低。这是在没有TGF-β的情况下激活的OT1 T细胞抑制活性相对较弱的最可能的解释。然而，由于一些原因，裂解机制不太可能解释TGF-β活化的OT1的抑制活性。首先，与没有TGF-β的OT1 T细胞相比，TGF-β抑制了活化的OT1细胞的杀伤活性，但其抑制活性明显更强。其次，直接分析与TGF-β诱导的Ts孵育后的APC群并没有显示出这些细胞的清除(与在没有TGF-β的情况下激活的裂解活性细胞孵育后)，但显示出共刺激分子表达的特异性降低。第三，TGF-β激活Foxp3的表达和强大的抑制活性，类似于CD4+ Treg细胞，同时降低颗粒酶、IFN-γ的表达和溶解活性。第四，缺乏穿孔素基因的OT1 T细胞在没有TGF-β的情况下活化时不能产生任何可测量的CTL活性或抑制活性，但在有TGF-β的情况下活化时没有显示其抑制活性的减弱。因此，Foxp3+ CD8+ Ts细胞的抑制机制似乎独立于裂解机制。

TGF-β激活的OT1抑制的非溶解机制尚不清楚。这种抑制活性与提供SIINFEKL/Kb[52]的树突状细胞的共刺激分子表达减少相关，但与MHCI类或II类表达无关。这类似于CD4+ Treg抑制共刺激分子表达的报道[55,56]和我们自己未发表的TCR75 Treg的研究结果。降低共刺激分子的表达预期会降低对应答T细胞的强烈刺激，从而导致抑制。此外，这种调节的APC还可能诱导更多的调节性T细胞[54,57,58]，从而放大抑制。目前尚不清楚CD8+ Ts细胞和应答T细胞是否同时或依次与APC相互作用(图2)。然而，在我们的研究中，中和性抗TGF-β 1,2,3并没有抑制TGF-β激活的OT1的抑制作用，这表明正如其他人报道的[59,60]，从诱导培养中携带或由Ts细胞产生的TGF-β并没有参与该系统。白细胞介素IL-10是另一种经常被报道由CD4+ Tr1 T细胞分泌的免疫抑制细胞因子(综述见[61])。理论上，以APC为中心的抑制可能涉及低水平的免疫抑制性细胞因子(如IL-10)，这些细胞因子仅在短距离内发挥作用，从而抑制与同一APC结合的T细胞。为了验证这一想法，我们将OT1 Tg小鼠与IL-10-/-小鼠杂交。来自IL-10缺乏和充足的OT1小鼠的T细胞在B6.Kd刺激下具有相似水平的裂解活性。在诱导培养物中加入TGF-β可抑制OVA APC的表达。在TGF-β刺激下，IL-10缺乏的OT1 T细胞表现出与IL-10充足的T细胞相似的抑制活性，表明T细胞产生的IL-10不需要被抑制。此外，来自其他细胞的IL-10的潜在贡献被排除，因为在这些培养中加入中和量的抗IL-10不能逆转抑制。因此，IL-10似乎在CD8+ T细胞介导的抑制系统中没有发挥重要作用。

许多研究表明，在各种耐受诱导条件下产生的CD4+ Treg是移植排斥反应的有效抑制剂(综述见[62,63])。关于CD8+ Ts细胞在预防移植物排斥中的作用，我们所知甚少，但在稳定植入过程中，人[58]和大鼠CD8+ CD28- Ts细胞[57]中Foxp3自发上调。所述CD8+ CD28- Ts细胞表现出抗原特异性抑制活性。同样，TGF激活的OT1 T细胞一致表达CD25，形成表达Foxp3的细胞亚群，并在体外和体内介导抑制[52]，表明抑制可能是由Foxp3+ OT1 T细胞介导的。最近有报道称，在体内或体外用一种改良的非耗损性抗cd3单克隆抗体(hOKT3γ1)处理人T细胞可诱导表达FoxP3的CD8+ CD25+细胞[64]。抗cd3诱导的CD8+ CD25+ T细胞起源于CD8+ CD25-Foxp3- T细胞，抑制同系CD4+ T细胞在有丝分裂原或抗原刺激下的反应。虽然尚不清楚这些多克隆CD8+ CD25+ T细胞是否特异性地抑制应答，但它们需要与应答的CD4+或APC群接触。这些研究表明，Foxp3可能是CD8+ T细胞功能的关键调节因子，就像它在CD4+ Tregs中所做的那样;然而，在这些系统中，CD8+ T细胞的抑制活性是否仅为Foxp3细胞所特有还有待确定。

为了确定这种抑制活性是否仅限于Foxp3+ TGF-β激活的OT1，我们将Foxp3 GFP敲入(Foxp3gfp)小鼠[25]与OT1 TCR转基因小鼠杂交。初步结果表明，双Tg小鼠在初始小鼠中没有检测到GFP OT1 T细胞水平，这与我们在TCR75 Tg小鼠中观察到的情况相似。然而，在体外，TGF-β诱导CD8+ T细胞亚群表达GFP (Foxp3+)， GFP+ T细胞抑制B6抗kd CTL反应，而GFP- T细胞没有。此外，GFP+ OT1 T细胞表现出与先前报道的TGF-β激活的OT1 T细胞连锁的抑制。这些结果表明，CD8+细胞中Foxp3的表达调节其抑制活性，就像在CD4+ Treg细胞中一样。

我们在TCR Tg Treg和Ts细胞中均观察到连锁抑制，这与之前针对Treg的这一问题专门设计的两项体外研究形成了对比[65,66]。当然，Treg可能在某些情况下表达细腻的抗原特异性，但在其他情况下表达非特异性活性，正如人们长期以来对CD4辅助性T细胞所认识的那样。然而，经典CD4+ T细胞的非特异性活性与可发挥远距离作用的细胞因子的分泌相关，而Takahashi等[65]和Thornton等[66]研究的Treg以接触依赖性方式抑制应答。

我们尚不完全清楚如何协调这两种结果，但由于实验设计中的注意事项，支持Treg抑制作用非特异性的数据并不明确。在Takahashi等人[65]的研究中，来自BALB/c小鼠的CD4+ CD25+ T细胞表达D011.10或BOG1 TCR转基因(它们识别不同但无交叉反应的OVA表位)，当在培养中包含这两种肽时，交叉抑制了对另一抗原的反应。这些结果不应作为非特异性抑制的证据，因为试验培养物中的APC可以结合这两种肽，从而同时将抗原提呈给应答者和调节性T细胞。因此，Takahashi等[65]的结果与我们的双转基因APC系统中观察到的抑制类似，只是他们没有报告单独脉冲APC的混合物刺激培养的结果，这将使他们能够区分旁观者和连锁抑制。在Thornton等人[66]报道的研究中，来自两种不同TCR转基因小鼠的Treg抑制作用不仅在培养物中同时存在两种抗原时被观察到，而且在抗原由单独负载两种抗原的APC混合提呈时也被观察到。虽然这些结果似乎表明抑制是非特异性的，但该实验并不确定，因为调节性和效应性T细胞是从足够重组酶(Rag)的TCR Tg小鼠中获得的。现在已经明确，来自这些小鼠的T细胞可以表达双重TCR，因为内源性TCR-α基因的表达可以与TCR-β链配对，从而产生具有识别两种独立抗原的潜力的T细胞[67-69]。这在Thornton及其同事的研究中尤为重要[66]，因为TCR Tg Treg细胞是从表达不同MHC单倍型的小鼠中获得的。因此，测试培养物必须包含表达两种不同MHC单倍型的APC。由于来自Rag充足小鼠的TCR Tg Treg有可能识别同种异体抗原和TCR转基因指定的名义表位，因此在没有名义抗原的情况下，可以通过对APC的同种异体识别，将抑制作用靶向到MHC不匹配的应答T细胞，从而产生非特异性抑制。我们的数据表明，FoxP3+ Tregs和Ts在体外可以表现出比以前更高程度的抗原特异性抑制活性，并表明支持Tregs非特异性抑制的数据应谨慎解读。

虽然Treg细胞在控制移植排斥反应中的作用已被许多研究小组研究，但CD8+ Ts细胞的作用尚不完全清楚。我们开始研究TCR Tg OT1 T细胞是否可以抑制由Kd特异性CD4+ TCR75 T细胞介导的心脏移植排斥反应。只有当Ts细胞在TGF-β存在的情况下被激活，并且只有当Kd心脏也表达OVA[52]时，才会观察到抑制，表明相关的抑制也在体内表现。Liu等报道，通过输注供者特异性紫外线- b照射的血液，大鼠体内表达Foxp3的CD8+ T细胞被激活，当这些T细胞转移到初始同基因宿主时，心脏移植存活时间延长[69]。与OT1 T细胞一样，耐受大鼠的CD8+ T细胞具有抗原特异性，并以接触依赖的方式抑制对耐受的同种抗原的增殖反应。此外，过继转移的CD8+ Ts细胞抑制心脏移植排斥反应仅限于耐受的心脏供体，而不是无关的心脏供体。这些数据表明CD8+ T细胞在其激活和抑制活性方面具有抗原特异性。因此，TGF-β激活的OT1 T细胞，如MLR诱导的CD8+ Ts[38]和移植患者的供者特异性CD8+ Ts[46,71]，仅抑制与诱导抗原相关的抗原的反应，这表明抑制是通过直接细胞接触而不是细胞因子释放介导的，并且是CD8+ Ts细胞和CD4+ Tregs的共同特征。CD8+ T细胞和CD4调节性T细胞具有功能特异性，支持其作为免疫调节剂应用于临床的可行性。如果相同的APC呈递两种抗原，Treg和Ts可抑制对不同抗原的效应T细胞应答，这一能力有望扩大它们在治疗自身免疫和移植排斥反应方面的效用，其中涉及对多种抗原具有特异性的致病性T细胞，而无需识别每个表位。CD8+ OT1 Ts在体内外抑制反应的机制尚不清楚;然而，IL-10和TGF-β似乎都不是必需的。目前正在研究是否利用已在Treg中发现的其他途径(如吲哚胺2,3-双加氧酶[72])或在CD8+ CD28- Ts中发现的其他途径(如PIR-B[70,73])。

在经CD4+ CD25+ Treg细胞浸润的耐受同种异体移植物中检测到Foxp3 mRNA水平升高[74,75]，免疫组化证实表达Foxp3蛋白的T细胞存在于肿瘤中[76]和耐受同种异体移植物中[77,78]。我们的数据还表明，TGF-β激活的FoxP3+ OT1 Ts细胞在移植到心脏受者3天后迁移到心脏但没有迁移到淋巴组织，而FoxP3- OT1细胞迁移到心脏和脾脏[52]。我们的研究没有解决FoxP3+ CD8+ T细胞是否能在次级淋巴组织水平产生和介导抑制，因为CD8+ T细胞在过继性转移之前就被激活了。因此，它们优先迁移到心脏而不是淋巴组织最有可能反映了这些细胞的活化状态，如同之前报道的CD4+ TCR Tg T细胞[79]。同种异体移植物内的排斥反应抑制也可以由树突状细胞(DC)水平的OT1 T细胞介导，因为心脏移植后主要在脾脏中激活的TCR75 T细胞迁移到心脏，在那里它们经历了额外的增殖和细胞因子的上调[79]。相反，活化的TCR75 T细胞也会迁移到移植受者的小肠，但它们在小肠内不会发生增殖，这可能是因为小肠内没有抗原[79]。这些结果提示，在这种过继转移模型中，抑制可能是在移植器官内而不是在淋巴组织内介导。我们的结果与表达适当归巢受体的Treg[80]迁移到炎症部位，并在那里抑制效应T细胞的应答[81,82]的观察结果一致。

关于抗原特异性CD4+ Treg和CD8+ Ts细胞在维持自身耐受的总体机制中所起的作用，以及在它们介导抑制的细胞和分子途径中所起的作用，仍有几个问题有待解决。一个尚未解决的问题是胸腺中在初始组库发育过程中产生的“天然”Treg与外周中由初始Foxp3- T细胞产生的“诱导”调节性细胞之间的关系。由于静息状态下正常淋巴组织中存在的CD8+ Foxp3+细胞很少，因此在选择胸腺中Treg发育的MHC I和MHC II表位范围方面似乎存在显著差异，或者由于谱系特异性差异，CD8+ T细胞固定Foxp3表达的能力较弱。第二个尚未解决的问题是被CD4或CD8调节细胞有效抑制的不同免疫效应活性范围。一种可能性是抑制APC共刺激活性的能力是T细胞活化的基本机制，因此许多不同的效应通路受到影响，在某种程度上它们依赖于高效的APC。因此，对APC共刺激依赖性较低的记忆T细胞的活化对Treg活性的敏感性可能低于初始反应的启动。另一个有待解决的问题是，在什么情况下，这些Foxp3细胞可能发展出分泌抑制因子的能力，如TGF-β和IL-10。虽然我们的数据表明，TGF-β激活的Foxp3+ CD4+和CD8+调节性细胞在抑制原发免疫应答时并没有利用这些抑制性细胞因子，但有报道称，Treg和Ts细胞参与了涉及慢性抗原存在的几种体内抑制模型，包括自身抗原[83,84]、移植组织中的同种异体抗原[85]和肿瘤[86]。另外，当Foxp3细胞在炎症环境中受到刺激时，可能会诱导产生抑制因子。