北大最新《Nature》：揭示肝癌新疗法！

intelUNION 2023-01-23 发布于河南

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肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，我们国家属于全球肝癌发生率相对较高的区域（占全球发生率~47%）。在每10万中国人中，会有8~10个以上患有肝癌。尤其是某些高危人群出现乙肝丙肝患者或者是高危人群发生，是每10万人有500多人。原发性肝癌（PLC）有三种主要的组织学亚型：肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和肝细胞和肝内胆管联合癌（CHC）。在现有的一些治疗方案中，由各种免疫细胞和基质细胞组织的肿瘤免疫微环境（TIME）的异质性是肿瘤转移、复发和耐药的主要因素，然而目前对于PLC的TIME分布了解十分有限，无法识别生物标志物以更好地进行患者分层，以至于无法深入理解不同的TIME亚型与肝癌的临床相关性。

图1 用于治疗肝癌的肝脏切除及转移手段

近日，来自北京大学第一医院的张宁和北京大学生命科学学院的张泽民教授团队通过对肝癌细胞异质性进行详细分析，阐明了不同的TIME亚型，揭示了TAN的免疫抑制功能以及针对TAN的潜在免疫疗法。研究将患者分为五种TIME亚型：免疫激活、骨髓或基质细胞介导的免疫抑制、免疫排斥和免疫滞留表型，并发现不同的TIME亚型在空间上存在有序组织，与趋化因子网络和基因组特征相关。另外，研究也发现富含骨髓细胞介导免疫抑制亚型的肿瘤相关中性粒细胞（TAN）患者具备不良预后，并提出潜在针对TAN的疗法。相关研究以“Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”为题于2022年11月09日发表在国际顶级期刊《Nature》。

1. 大规模肝癌单细胞图谱

为了含括所有细胞群的PLC的TIME分布，研究对124名未接受治疗的患者的160个临床样本进行了scRNA-seq分析，其中包括79名HCC患者、25名ICC患者和7名CHC患者。最终共鉴定出89个TIME细胞簇，所鉴定的TIME细胞簇表现出与病因有关的组织性和癌症类型偏好。与来自不同患者细胞的TIME簇相比，肿瘤细胞簇往往具有患者特异性。基于代表真实流行病学的PLC亚型组成，研究者们通过多方面数据，例如临床信息、不同人群和匹配基因组图谱的单细胞图谱，成功对PLC的细胞异质性情况进行了大规模分析。

图2 来自124例肝癌患者的样本单细胞图谱

2. 五种TIME亚型的揭示

为了研究PLC的TIME亚型，研究者对肿瘤组织中细胞的共富集模式进行了检测分析，通过层级聚类确定了五个稳定的细胞模块（CM1–CM5）。进一步的，基于CM1–CM5的差异富集，研究提出了一种新型的分类方案“TIMELASER”，用于单细胞分辨率下的肿瘤免疫微环境亚型分类，并成功将研究中不同患者分为五个相应的TIME亚型，该分类的特性依据包括四个方面：（i）细胞簇，（ii）功能标记基因表达，（iii）TIME相关基因信号和（iv）预后相关性。通过索引（CODEX）分析代表性样品和重新分析PLC33的空间转录组进行联合检测，研究者们成功地再现了每个亚型的细胞组成，从而进一步证实TIMELASER分类方案的可行性。通过外显子组数据分析，研究发现TIMELASER亚型表现出不同的趋化因子网络，并与肿瘤细胞的不同体细胞改变和转录组学特征相关。

图3 PLC的五种TIME亚型

3. 肝癌中性粒细胞异质性

接下来，在TIME-ISM中多个中性粒细胞亚群的富集、及其与不良预后关联的促使下，研究者们进一步对肝癌中性粒细胞进行了系统分析。通过mIHC，研究证实PLC含有中性粒细胞即表明ICC的中性粒细胞明显多于HCC。最终整体结果展现了总共11个中性粒细胞亚群的异质性分层图谱，并表面中性粒细胞分化可能是由转录因子以时空方式进行协调的。此外，为了系统地检测TAN的功能，研究通过将人PBN与三种人肝癌细胞系HepG2、HCCLM3和MHCC97H以及对照细胞系HEK293T共培养来进行体外诱导TAN，结果表明PBN和ALN亚群的信号下调，而大多数TAN亚群被上调，其中Neu_11_CCL4的信号最高，与scRNA-seq数据相符。此外，通过对Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1两个TAN亚群的表型和功能进行重点研究，研究者们发现与IFNγ⁺细胞的相互作用可能有助于Neu_09_IFIT1的高PD-L1表达。为深入研究TAN在体内的异质性功能，研究构建了两种新的自发性肝癌小鼠模型，其中pTMC小鼠主要发展为HCC，pTMK小鼠主要发展成ICC，以此得到的共17780个中性粒细胞被分成12个簇，显示出清晰的组织特异性和有序的发育轨迹，与人类中的中性粒细胞异质性一致。

图4 人类中性粒细胞异质性和功能验证

4. 减少中性粒细胞可缓解肿瘤病情

上述分析结果为在小鼠模型中研究基于中性粒细胞的治疗提供了基础，基于此，研究者们分析了体内针对TIME-ISM TAN（Neu_09/10/11）消除这些促肿瘤TAN亚群的治疗效果。由于没有针对Neu_09/10/11的组合体内消除策略，研究采用抗Ly6G抗体37的中性粒细胞清除以模拟此类治疗方法，结果发现中性粒细胞减少会导致肝癌结节和肿瘤重量的显著减少。从本质上来讲，该过程主要是由于中性粒细胞耗竭可以减弱巨噬细胞募集和T细胞抑制，从而产生对肿瘤的抑制作用。并通过对8个独立样本进行scRNA-seq，进一步研究了抗Ly6G治疗期间的中性粒细胞动力学，证实在小鼠模型中，中性粒细胞的耗竭可以改变TAN的组成并减弱肿瘤的进展。

图5 小鼠模型中中性粒细胞的异质性和耗竭影响

5. 总结与展望

总结一下，这篇工作基于对~1.3 亿细胞进行大规模、无分类的单细胞分析，得到了PLC的全面细胞图谱，分出了五种TIMELASER亚型并解码中性粒细胞异质性，并且也详细鉴定了一种在人类和小鼠之间广泛保守的中性粒细胞谱，并推测促肿瘤CCL4⁺、SPP1⁺和PD-L1⁺TANs是极具潜力的免疫治疗靶点。对这些数据的深入分析、以及功能研究，将为肿瘤时间和时间串扰提供新的见解，也将有利于识别免疫细胞功能，并指导识别免疫治疗的生物标志物或靶点。研究者们表示，进一步探索中性粒细胞对免疫疗法和相关混杂临床因素的影响，将为更好地理解TAN生物学提供新的方向，并推动发展治疗肝癌的转化研究路径。