 导语 今天给同学们分享一篇单基因的生信文章“Identification of ZBTB9 as a potential therapeutic target against dysregulation of tumor cells proliferation and a novel biomarker in Liver Hepatocellular Carcinoma”，这篇文章于2022年12月15日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为5.531。据报道，ZBTB9与许多肿瘤的发展有关。然而，在肿瘤发生和发展过程中，ZBTB9的作用及其在肝细胞癌(LIHC)中的预后价值尚未得到阐明。研究结果表明，ZBTB9被确定为预测LIHC预后和肿瘤进展的新型生物标志物，以及逆转肿瘤发展的有前途的治疗靶点。 1. ZBTB9在LIHC中的异常表达 肿瘤样本中异常表达的基因被认为可能参与了肿瘤的发生和发展。在此，作者主要发现与具有TIMER2泛癌数据的相应正常组织相比，ZBTB9在15种类型的肿瘤中显着上调，包括BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、HNSC-HPV(−)、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD和UCEC（图1A）。此外，通过TCGA-LIHC数据，表明ZBTB9是与相邻正常组织加GTEx正常组织相比，LIHC样本中显着过表达（图1B）。然后基于GEO数据库的GSE76427和GSE36376，与正常组织相比，在LIHC肿瘤组织中也检测到ZBTB9的明显上调（图1C，D）。为了进一步证实这些发现，作者还发现ZBTB9在肿瘤样本中显着更高（图1E-H）。  图1 ZBTB9的表达 2. ZBTB9与临床病理特征的相关性 通过UALCAN数据库分析了ZBTB9表达水平与不同临床特征之间的相关性，这表明ZBTB9表达与更高的个体分期和肿瘤分级显着相关（图1M，N）。上述发现表明ZBTB9在包括LIHC在内的多种癌症中过表达，并与肿瘤分级和分期显着相关，因此其在肿瘤发生和预后中的作用值得进一步研究。 3. ZBTB9的遗传改变和启动子甲基化分析 通过cBioPortal（图2A）数据库研究了ZBTB9基因突变和改变。根据结果，其基因改变的主要类型是“突变”，在大部分TCGA癌症中观察到，“扩增”是第二常见的。此外，372例LIHC患者ZBTB9变异频率为2.69%，包括“突变”和“扩增”。癌症中的“深度缺失”类型很少见。作者进一步探讨了ZBTB9在癌症中的特定突变类型和位点（图2B）。然后，借助COSMIC还观察了突变类型的概况。主要突变类型为错义替换，与cBioProtal结果相似，主要替换突变类型为G⟉>⟩A（30.91%）和C⟩>⟩T（30.91%）（图2C）。通过UALCAN进行甲基化分析，作者分析了ZBTB9的甲基化水平，结果表明ZBTB9在LIHC肿瘤组织中的启动子甲基化水平明显低于邻近的正常组织（图2D）。就个体癌症分期和肿瘤分级而言，存在甲基化越低伴随肿瘤分期和肿瘤分级越高的趋势，这在肿瘤分级中更为显着（图2H和I）。这些发现表明ZBTB9在某些癌症中的异常表达可能是通过基因改变和启动子低甲基化引起的，这将有助于对LIHC肿瘤发生的全面认知和潜在治疗策略的指导。  图2 ZBTB9基因改变和甲基化分析 4. 预后和诊断价值分析 基于LIHC队列的OS和DSS分析是通过R软件进行的。结果显示，ZBTB9的高表达与明显较短的OS和较短的DSS相关（图3A、B）。基于作者独立的79个LIHC样本的生存分析也表明ZBTB9是其OS的危险因素（图3C）。此外，利用coxph函数，进行cox比例风险回归分析，分析ZBTB9在癌症中的HR，这表明ZBTB9是许多癌症的重要危险因素，包括GBMLGG,SKCM-M,LAML,SARC,SKCM,LAML和LIHC（图3D），这些结果表明，相对高水平的ZBTB9通常与肿瘤患者的较差结果有关。此外，ROC下的面积为0.909（图3E）。这些结果进一步表明ZBTB9的表达水平易与LIHC患者较短的生存期相关，也证实了ZBTB9参与了LIHC的发生和发展。  图3 ZBTB9的高表达表明LIHC患者的生存率较差 5. 不同亚型的生存分析 还进行了Kaplan-Meier生存曲线分析，以评估ZBTB9在不同临床特征下的预后价值。结果表明，ZBTB9高表达是24个亚型的明显危险因素，所有P值小于0.05。  图4 ZBTB9在不同临床亚型中的生存分析和药理反应 6. ZBTB9表达与TIME的相关性 因此，作者进行了分析，探讨LIHC中淋巴细胞浸润、趋化因子、免疫检查点抑制剂和免疫检查点刺激剂之间ZBTB9表达的相关性，并针对每个部分提供了4个主要结果。它表明ZBTB9与主要免疫细胞的浸润呈负相关（图5A，B），包括Th1细胞，NK细胞，激活树突状细胞(DC)，激活CD8+T细胞，并且还与抑制剂呈负相关（图5C，D）。ZBTB9表达与刺激物之间的相关性仍主要为负相关（图5E、F）。此外，TIME的IHC显示，在两个肿瘤样本中，ZBTB9水平相对较高的患者具有相对较低的CD8A染色强度，ZBTB9水平与TIME中的CD8+T和Tregs呈负相关。  图5 ZBTB9水平与免疫力的相关性分析 7. 基因富集分析 基于Hallmarks基因集的富集结果表明，高ZBTB9与某些信号通路的激活有关（图6A-E）。这些途径可能是ZBTB9过表达后的潜在下游机制。随后的相关性分析表明，ZBTB9表达与KRAS信号通路的核心分子明显相关（图6F-J），表明ZBTB9作为LIHC中针对该通路的新型治疗靶点的潜在价值。  图6 ZBTB9高表达组和ZBTB9低表达组之间的基因集富集分析 8. 药效分析 从CellMiner获取药理疗效和mRNAs水平数据，分析IC50与ZBTB9基因表达水平的相关性，结果表明ZBTB9水平与BMS-911543，Defactinib，ITRI-260，Dovitinib，BPR1J-097，TPX-0005，CG-806，CFI-402257和BLU-667的IC50呈显着负相关,与氟达拉滨,克拉屈滨正相关,有助于优化指导ZBTB9高表达LIHC患者的个体化治疗。  图7 ZBTB9表达与药物IC50之间的相关性 9. ZBTB9相关基因的鉴定及相关生物学功能分析 使用STRING工具，选择ZBTB9结合蛋白，在之前的研究中验证，有10个ZBTB9结合蛋白，WDR46，PFDN6，VPS52，SLC39A7，COL11A2，HSD17B8，PHF1，RGL2，CUTA，TAPBP（图8A）。此外，作者还通过GEPIA2工具获得了前50个基因，这些基因与LIHC中的ZBTB9表达呈正相关。然后对上述TopZBTB9共表达的50个基因进行GO/KEGG分析。R软件计算结果如图8B、C所示，表明ZBTB9相关基因可能与剪接体过程、序列特异性mRNA结合、双链RNA结合、组蛋白结合、核复制体和RNA聚合酶II转录因子，均参与细胞增殖。此外，Metascape的结果也与上述发现相似，表明这50个基因与mRNA代谢过程和染色质组织核糖核蛋白复合物生物发生有关（图8D）。此外，利用GEPIA2结果的前10个基因和PPI结果的10个基因，通过TIMER2与ZBTB9在癌症中进行共表达分析。结果通过热图可视化（图8E、F），显示这20个基因在大部分癌症中大多与ZBTB9共表达。  图8 ZBTB9相关基因的鉴定及相关生物学功能分析 10. ZBTB9相关基因的预后价值分析 根据Kaplan-Meier生存曲线分析结果，上述20个基因中有7个显示阳性结果。这些对ZBTB9相关基因的分析可能表明这些分子共同促进了肿瘤进展。  图9 ZBTB9相关的7个基因预后和免疫相关分析 11. 顶级相关基因的功能分析 利用GSCALite工具，作者分析了上述7个基因与ZBTB9在LIHC中的共同作用，表明这些基因主要触发细胞周期通路激活和DNA修复，然后导致肿瘤进展（图10A、B）。  图10 LIHC中8个基因的功能分析 12. 体外实验验证 首先，通过RT-qPCR评估siZBTB9-1和siZBTB9-2的敲低效率，结果表明siRNA降低了HepG2细胞中ZBTB9的mRNA水平（图11A），随后的WB实验也验证了这一点（图11A）。通过集落形成测定检查ZBTB9敲低对细胞增殖的影响。与siCtrl组相比，ZBTB9敲低组中HepG2集落组的数量显着减少（图11C、D）。伤口愈合测定的结果还表明，与siCtrl组相比，在相同的16小时间隔后，在ZBTB9敲低组中观察到更宽的伤口（图11E、F）。进行流式细胞术分析以分析ZBTB9敲低对细胞周期的影响。结果表明，与siCtrl组相比，两个ZBTB9敲低组的G1期细胞数显着增加，S期和G2期细胞数减少（图11G），提示通过阻断HepG2中的ZBTB9，细胞增殖能力明显受损。此外，使用transwell实验评估了ZBTB9敲低对细胞侵袭的影响，结果表明ZBTB9敲低显着降低了HepG2细胞的侵袭能力（图11I，J）。上述实验结果表明，在HepG2细胞中敲低ZBTB9后，细胞增殖和迁移能力明显受到抑制，有力地证实了作者之前的结果。 图11 体外实验 总结 研究基于多组学、实验和临床样本的证据，确定ZBTB9是ZBTB蛋白的成员，可促进肿瘤增殖和迁移，具有成为新型生物标志物和提供新治疗方法的强大潜力LIHC患者的目标。对单基因相关感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！ 生信分析定制服务 请扫描下方二维码 |
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