CRISPR-Cas9常见问题解答（FAQ），助您轻松解决实验困惑！

一土山人 2023-02-02 发布于上海

展开全文

3496 人阅读发布时间：2021-05-21 13:56

CRISPR-Cas9作为目前最常使用的基因编辑系统，已广泛应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。CRISPR-Cas9基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。然而，在基因编辑实验中我们却经常会被一些问题所困扰，特别是对于新手小白来说。下面小编就以riboEDIT™ CRISPR-Cas9为例，汇总了基因编辑实验中常见的一些问题解答，希望可以对正在或即将要进行CRISPR-Cas9基因编辑实验的各位小伙伴们有所帮助！

riboEDIT™ CRISPR-Cas9是锐博生物自主开发的采用天然复合物系统的即用型(Ready-to-Use)基因编辑体系，gRNA采用crRNA和tracrRNA，提供全RNA体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA)和RNP体系(crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein)，充分借助化学合成技术优势和质谱检测以确保质量稳定，通过化学转染、显微注射或电穿孔/电转进行编辑，是大规模文库筛选的理想选择。该体系不需要自行构建gRNA载体或Cas9载体，无需病毒实验室，无需前期测序鉴定，无DNA组分，不整合病毒或质粒基因，轻松实现单靶点或多靶点编辑，简化基因编辑实验步骤，数倍缩短实验时间。还提供编辑效率保证套装和配套必需试剂，为基因编辑提供方便、省时、高效的解决方案。

常见问题解答（FAQ）

1. riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系的gRNA是何种形式的？是100nt的体外转录合成的gRNA吗？

答：体外转录或克隆形成的single guide RNA（即sgRNA），长度约100 mer，需经历摇菌培养、载体表达、挑选阳性克隆、测序鉴定等，或通过包病毒步骤，非常繁琐。构建好的gRNA质粒、慢病毒、腺病毒会整合到宿主基因，载体体积大，免疫源性，转染效率低、细胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。

riboEDIT CRIPSR-Cas9系统采用近两年来被全球科学家越来越多采用的天然复合物gRNA，即crRNA和tracrRNA，无需体外转录，采用高通量化学合成以确保其纯度、效力和批次稳定性。因不需要载体或病毒，上述问题可避免。其中，crRNA和tracrRNA为专利技术优化，缩短了碱基序列长度。不同于常规gRNA，由crRNA、tracrRNA与S. pyogenes Cas9（编码序列经人源密码子优化）构成编辑效率更高的CRISPR-Cas9体系，如下图所示。

2. riboEDIT CRIPSR-Cas9体系相比于质粒载体表达Cas9和Cas9稳定表达细胞株或慢病毒系统有什么优势？

答：riboEDIT™ CRIPSR-Cas9的全RNA体系或Cas9蛋白体系相比质粒载体或Cas9稳定表达细胞株而言具有以下优势：

（1）Cas9蛋白为瞬时表达，脱靶效率低、无DNA整合风险和启动子兼容性问题，大大提高应用安全性。

（2）即用型体系，通过一步转染，5-6个工作日即可完成编辑效率检测，操作简便，显著缩短实验周期。

（3）不需要自行构建载体或包装慢病毒，不需要病毒级的实验室环境。

（4）在大部分细胞中，比质粒表达载体具有更高的基因编辑效率。

3. 使用riboEDIT Cas9 mRNA进行细胞基因编辑，如何确定细胞的转染效率？

答：高转染效率是获得高效基因编辑效率的必要条件，可通过转染EGFP mRNA或其它荧光蛋白mRNA 来确定细胞的转染效率。riboFECT mRNA转染试剂可实现各种细胞类型，包括干细胞和原代细胞的高效率、低毒性转染，从而提高Cas9 蛋白剪切和基因重组效率。对于转染试剂难以达到理想转染效果的细胞，推荐使用电转、显微注射等方式，具体实验条件需要自行优化。

4. riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于显微注射？

答：可以，riboEDIT Cas9 mRNA 浓度为0.5μg/μL，建议显微注射前调整浓度到20-200ng/μL 范围，并采用0.2μm针式过滤器确保去除所有可能堵塞显微注射针头的颗粒物或细菌。

5. 如何快速确定crRNA的有效性？

答：crRNA/ tracrRNA 剪切效率与crRNA识别的靶序列有关，不同的crRNA剪切活性不同，推荐通过体外酶切实验，在体外酶切靶DNA片段，快速筛选有效的crRNA，获得高编辑效率的crRNA再进行后续的实验。

6. riboEDIT™ CRISPR-Cas9基因编辑系统识别的PAM序列是什么？

答：riboEDIT™ Cas9 mRNA和riboEDIT™ Cas9 Protein S. pyogenes Cas9为S. pyogenes Cas9，识别PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。

7. riboEDIT™ Pre-designed crRNA如何保证低的脱靶效率？

答：从crRNA的设计角度，使用更严格的序列比对分析，建议每个基因至少设计3-6条crRNA进行有效性筛选。

8. T7EI酶切检测编辑效率发现无剪切条带是什么原因？

答：可能原因如下：

（1）细胞转染效率低，建议优化转染步骤或换用容易转染的细胞类型。

（2）Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通过设置阳性对照组（riboEDIT Positive Control crRNA #1，货号crRP0001VS）共转染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的问题。

（3）在细胞内，Cas9核酸酶无法接近靶位点或无法剪切靶位点，建议重新设计crRNA。

（4）没有进行DNA片段的变性、退火步骤。可通过设置阳性对照组确认实验操作是否有误。

9. 琼脂糖凝胶电泳分析剪切效率时非特异性条带多，无法分析剪切效率怎么办？

答：可通过设置阴性对照组来区分目标剪切条带和非目标条带。必要时，需重新设计引物，或通过优化PCR条件，来降低非特异性扩增。建议采用巢式PCR，提高扩增片段的特异性。

10. T7E1 突变检测时，出现条带弥散的现象，应该如何解决？

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特异切割DNA 链的能力，所以遇到这种情况，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，减少酶切时间来降低非特异切割现象。

11. 对于从事诸如干细胞、原代细胞或悬浮细胞，应该选择哪一种riboEDIT™ CRIPSR-Cas9体系？

答: 干细胞、原代细胞或悬浮细胞等难转染细胞，转染试剂一般很难达到理想的转染效果，电转方式更适合这类细胞的转染，根据目前文献支持，Cas9 RNP体系用于电转具有更高的基因编辑效率，对于上述难转染的细胞推荐用riboEDIT™ CRISPR/Cas9 RNP体系，具体实验条件需要自行优化。

12. riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多个靶点或基因的编辑？

答：可以，通过混合多条crRNA与tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共转染，可实现对多个靶点或基因的编辑，最佳共转染体系需自行优化，请保证crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

13. mRNA 转染与DNA 转染相比，有哪些优势？

答：（1）DNA 转染需要进入细胞核，对于快速分裂的细胞才能达到理想的转染效果，而mRNA 转染只需进入细胞质，可大大提高有丝分裂后细胞或缓慢分裂细胞的转染效率。（2）没有转录过程，蛋白表达更快速，缩短实验周期。（3）更加安全，无DNA 整合风险。

14. 如何用riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 转染Cas9 mRNA 和sgRNA 进行基因编辑？

答：riboFECT™ mRNA Transfection Reagent 适用于转染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的双链DNA 或HDR 模板。尤其适用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共转染进行基因编辑，转染步骤请参照《riboEDIT™ CRISPR-Cas9 体系使用说明》实验方法部分riboEDIT™ CRISPR/Cas9 mRNA 操作说明。当利用CRISPR 做基因敲入，需自行优化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共转染体系，以获得最佳效果。