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题目：A family of methyl esterases converts methyl salicylate to salicylic acid in ripening tomato fruit 刊名：Plant Physiology 作者：Elizabeth M Frick ， Harry J Klee et al 单位：University of Florida, Gainesville 日期：1, January 2023    01 摘要  水杨酸甲酯具有强烈的味道和香气，与中药和冬青味相似，这在番茄（Solanum lycopersicum）中是不被认可的。植物通过多种生物合成途径控制水杨酸甲酯的数量，包括水杨酸甲基化形成水杨酸甲酯，随后糖基化防止水杨酸甲酯排放。 在这里，我们鉴定了番茄甲酯酶的一个子类，水杨酸甲酯酶1-4，负责水杨酸甲酯的脱甲基化，在水果中形成水杨酸。该家族通过接近2号染色体上一个高度显著的水杨酸甲酯全基因组关联研究位点而被鉴定。在一个双生子群体中进行的遗传图谱研究证实了2号染色体上的一个主要水杨酸甲酯基因座。来自SlMES1敲除系的果实显著排出比野生型水果更高的水杨酸甲酯量。SlMES2、SlMES3和SlMES4的双突变体和三突变体比SlMES1的单敲除释放出更多的水杨酸甲酯，但与单突变体相比，没有统计学上可区分的水平。 异源表达的SlMES1和SlMES3在体外作用于水杨酸甲酯，SlMES1对水杨酸甲酯的亲和力高于SlMES3。SlMES基因座发生了重大的重排，这一点在双亲群体的基因组结构分析中得到了证明。 对产生高或低水平水杨酸甲酯的材料的分析表明，在低水杨酸甲酯系中，SlMES1和SlMES3基因表达最高。没有一个MES基因在高水杨酸甲酯生产系中明显表达。我们得出的结论是，SlMES基因家族编码番茄甲基酯酶，在成熟的番茄果实中将水杨酸甲酯转化为水杨酸。它们通过转化为水杨酸来降低水杨酸甲酯水平的能力是一个有吸引力的育种目标，以降低风味的负面贡献者的水平。 02 技术路线  Generation of slmes loss-of-function mutants Expression of SlMES1 and SlMES3 in E. coli SlMES1 substrate determination SlMES1 and SlMES3 kinetic parameter determination SlMES1 reaction product determination GWAS analysis Linkage mapping in the biparental population Phylogenetic tree construction RNA-seq analysis、qRT-PCR 03 主要结果 3.1 控制番茄果实中水杨酸甲酯水平的MeSA2.1的鉴定 为了鉴定影响水杨酸甲酯排放的基因，对166份番茄材料的种群进行了鉴定。水杨酸甲酯水平的全基因组关联研究（GWAS）确定了2号和9号染色体上与水杨酸甲酯水平高度相关的基因座（图2）。
为了确认2号染色体位点的重要性，我们从两个SLC材料BGV006931和BGV014508中开发了一个双分离群体，它们在GWAS小组中产生了接近最高和最低的水杨酸甲酯。不同F2植株（n=145）中的水杨酸甲酯水平呈倾斜分布，这表明一个隐性性状由多个基因座控制（图3A）。 我们为第2和9号染色体上的两个GWAS基因座生成了分子标记，并发现了两个数量性状基因座（QTL），每个QTL的比值对数（LOD）得分为9.6，分别命名为MeSA2.1和MeSA9.1（图3B）。这两个QTL共同占表型变异的20.2%和19.2%，这两个基因组合对分离群体中的挥发性水平产生了42.4%的影响（图3，B和C）。位点MeSA9.1与NSGT1重叠，NSGT1对水杨酸甲酯和愈创木酚都具有已知活性。重要的是，NSGT1的隐性和非功能等位基因与MeSA2.1的隐性等位基因结合，导致水杨酸甲酯水平升高，其相互作用的显著水平为P57.4 e–13。来自GWAS的MeSA2.1基因座的显著SNPs和双生子群体中最显著的标记与Solyc02g065240的距离小于1kb（图2）。两个亲本中MeSA2.1的基因组结构显著不同（补充图S1）。产生低甲基水杨酸盐的亲本BGV014508与番茄参考基因组更相似，而高产亲本BGV006931在基因座上基因之间的距离更短（图3D；补充图S1）。SL4.0中有四个全长基因在MeSA2.1处注释为甲基酯酶，我们将其命名为SlMES1-4（NCBI基因ID:SlMES1-101261578 SlMES2-101261293，SlMES3-112940921 SlMES4-101260990）（图2和3，D）
3.2 MeSA2.1是控制水杨酸甲酯积累的主要效应位点 由于水杨酸甲酯是一种多基因性状，具有几个重要的基因座，因此我们希望在没有其他基因（特别是第9号染色体NSGT基因座）贡献的情况下，确定SlMES的变异效应。我们比较了两种SLC系材料，它们在水杨酸甲酯途径中的许多已知基因几乎相同，但在MeSA2.1位点上不同（表1和图4）。这些已知的基因是邻苯二酚O-甲基转移酶（Solyc10g005060），其使前体邻苯二酚甲基化（Mageroy等人，2012），水杨酸甲基转移酶类（Solyc09g091530和Solyc09g 091540），其将水杨酸转化为水杨酸甲酯（Tieman等人，2010），以及先前描述的NSGT1基因座（Tikunov等人，2013；Aloge等人，2020）（表1）。BGV008218与Heinz 1706参考基因组最相似，且水杨酸甲酯水平较低。与MeSA2.1处的参考序列相比，BGV006779具有多个插入和SNP，并且含有高水平的水杨酸甲酯（表1）。水杨酸甲酯积累的显著差异表明，MeSA2.1可能独立于其他已知的水杨酸甲酯基因影响水杨酸甲酯（图4）。
3.3 SlMES1-4的分子特征 编码的MES互补DNA（cDNA）的系统发育分析表明，MES1（Solyc02g065240）最可能是MES2、MES3和MES4的祖先（图5A）。在Heinz1706参考番茄中，预测SlMES1和SlMES4编码约200个氨基酸的蛋白质，而SlMES2和SlMES3更短（图5，B和C）。SlMES2携带一个过早终止密码子，而SlMES3由于插入导致蛋白质的更短版本而被截断。全长MES基因编码包含7–8个基序的蛋白质，这与马铃薯、本氏烟草和拟南芥的甲基酯酶一致（图5，B和C）。我们从两个缺少SlMES3插入的材料BGV006775和PAS014479中扩增了cDNA，并且都转录了该基因的较长版本，预计该基因编码两个额外的功能性蛋白基序（图5B）。
接下来，我们使用从成熟番茄果实中提取的RNA，通过逆转录-定量PCR（RT–qPCR）研究了四个MES基因的表达。所选择的材料产生了非常高或非常低的水杨酸甲酯水平，并包括绘图群体中产生高水杨酸甲酯的亲本。在高水杨酸甲酯积累的材料中，所有四个MES基因的表达都很低，甚至无法检测到（图6）。低表达与预测功能丧失和隐性等位基因的遗传分析一致。在低水杨酸甲酯产量的材料中，SlMES1和SlMES3在成熟番茄果实中表达良好。几乎所有材料中都检测不到SlMES2的表达，而无论水杨酸甲酯的产生如何，SlMES4的表达都很低或检测不到。功能性MES蛋白包含5个基序，1至5，预计从两个缺少SlMES3插入的材料中形成，BGV006775和PAS014479，并且都转录了一个较长版本的基因，预计编码两个额外的功能性蛋白基序（图5B）。接下来，我们使用从成熟番茄果实中提取的RNA，通过逆转录-定量PCR（RT–qPCR）研究了四个MES基因的表达。所选择的材料产生了非常高或非常低的水杨酸甲酯水平，并包括绘图群体中产生高水杨酸甲酯的亲本。 在高水杨酸甲酯积累的材料中，所有四个MES基因的表达都很低，甚至无法检测到（图6）。低表达与预测功能丧失和隐性等位基因的遗传分析一致。在低水杨酸甲酯产量的材料中，SlMES1和SlMES3在成熟番茄果实中表达良好。几乎所有材料中都检测不到SlMES2的表达，而无论水杨酸甲酯的产生如何，SlMES4的表达都很低或检测不到。功能性MES蛋白包含5个基序，1至5，预计形成SlMES1，因为该基因在成熟水果中表达，并预计编码全长蛋白。
3.4 SlMES1作用于植物中的水杨酸甲酯 为了测试MES基因在番茄果实中水杨酸甲酯转化为水杨酸的作用，我们使用CRISPR编辑技术对两个品种Brandywine Sudduth和Moneymaker的基因子集进行了靶向突变。所有的引导RNA都针对基因的第一外显子。在Brandywine Sudduth中，我们在一个转基因系中获得了SlMES1的移码缺失，在另一个系中获得SlMES1和SlMES2的移码删除（表2）。在这两种情况下，移码导致第一个外显子中的过早终止密码子（补充表S2）。在Moneymaker中，我们在SlMES1/SlMES3和SlMES1/SlMES3/SlMES4中获得了移码缺失，这也导致了过早终止密码子（补充表S2）。在田间和温室生长的植物中评估了SlMES1单突变体的多个等位基因。 在slmes1敲除品系中，水杨酸甲酯水平显著高于对照品（图7）。尽管环境导致了水杨酸甲酯总量的显著变化，但增加的水杨酸甲酯表型在实验中是一致的。一项温室实验表明，slmes1-1和slmes1-8植物分别比野生型多17.4和6.8个水杨酸甲酯，显著高于对照（图7B）。温室试验期间存在大量虫害和疾病压力，这可能解释了与田间试验相比，所有基因型中水杨酸甲酯的绝对水平较高。
3.5 SlMES基因缺失的影响 在Moneymaker背景中，slmes1单突变体与slmes3和slmes4双突变体和三突变体的组合使我们能够评估slmes1对水杨酸甲酯含量的贡献是否最大。除了slmes1单基因敲除外，我们还测试了slmes1基因敲除以及其他SlMES基因的缺失。slmes1-slmes2双突变体产生的水杨酸甲酯的量在统计学上与slmes1-8突变体没有区别，表明slmes2不是水杨酸甲酯去甲基化的重要贡献者（图7C）。这一结论与表达数据和基因座组织一致，预测了SlMES2中的过早终止密码子和大多数基因型中的低表达（图5、B和6）。三重slmes1 slmes3 slmes4移码突变体比Moneymaker对照组含有更多的水杨酸甲酯。然而，双和三移码突变体与slmes1单突变体没有显著差异（图7C）。这些结果支持这样的观点，即SlMES1是番茄果实中将水杨酸甲酯转化为水杨酸的最重要的甲基酯酶 3.6 SlMES1和SlMES3是作用于水杨酸甲酯的甲基酯酶 从成熟的Heinz 1706果实中克隆了SlMES1和SlMES3的cDNA，并在大肠杆菌中异源表达。该测定定量了挥发性底物的损失，假设底物转化为非挥发性水杨酸，如先前对其他水杨酸甲酯酶所述（Forouhar等人，2005）。含有等量SlMES1和SlMES3蛋白的反应表明，SlMES1比SlMES3更具活性，因为SlMES1能够在30分钟后使300 mM水杨酸甲酯完全脱甲基，而SlMES3在反应30分钟后剩余约20%的水杨酸甲酯起始浓度（图8A）。Heinz1706的SlMES3等位基因编码该蛋白的截短型，并且缺少两个关键基序。与SlMES1相比，该发现与SlMES3的活性降低一致（图5，B和8，B）。 为了确认番茄甲酯酶的作用机制与其他植物中先前表征的甲酯酶相似，我们评估了添加水杨酸是否抑制了SlMES1活性。水杨酸的加入竞争性地抑制了SlMES1的活性（图8B），这与先前的研究一致，表明水杨酸与活性位点口袋结合，并与水杨酸甲酯竞争活性位点。还计算了SlMES1和SlMES3与水杨酸甲酯的比活性。SlMES1的水杨酸甲酯KM为37.0±6.2 mM，与将水杨酸甲酯转化为水杨酸的其他甲酯酶相当，SlMES3的KM为237±6.8 mM，这与SlMES3将水杨酸甲酯转换为水杨酸的速度较慢一致（图8，a和C）。来自马铃薯的StMES1的KM为57.9 mM，烟草SABP2为8.6 mM，已经报道了KM为68 mM和24 mM的两种杨树甲基酯酶。因此，SlMES1和SlMES3具有与先前表征的植物甲基酯酶相似的KM值。
 04 结论 本文的结果是更全面了解成熟番茄果实中水杨酸甲酯合成的一个重要步骤。SlMES1、SlMES3和SlMES4的缺失导致成熟果实中水杨酸甲酯的显著增加，而SlMES1和SlMES3有效地使水杨酸甲酯脱甲基。选择MES基因表达最高的单倍型将为育种者提供降低成熟番茄果实中水杨酸甲酯风味的新选择。特别是，选择MES基因座最理想的单倍型与NSGT基因座的最佳单倍型相结合，应能显著减少水杨酸甲酯并改善风味。 05 原文获取 原文链接： https://academic./plphys/advance-article-abstract/doi/10.1093/plphys/kiac509/6782970?redirectedFrom=fulltext PDF获取： https://www./h-nd-152.html |
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