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编译：微科盟 思越，编辑：微科盟 景行、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载请注明来源于《转录组》公众号。 论文ID 原名：Combined Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal the Metabolic Evolvement of Breast Cancer during Early Dissemination 译名：单细胞和空间转录组学揭示了乳腺癌早期播散过程中的代谢演变 期刊：Advanced Science IF：17.521 发表时间：2023年1月 通讯作者：余科达 通讯作者单位：复旦大学附属肿瘤医院 DOI号：10.1002/advs.202205395 实验设计
结果 1 scRNA-Seq在乳腺癌原发灶和转移淋巴结中识别出早期播散的肿瘤细胞簇 为了对原发性肿瘤和转移性淋巴结的细胞组成和结构进行全面表征，研究者对4名乳腺癌患者肿瘤组织及配对腋窝淋巴结组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq，10× Genomics），这些组织是从复旦大学上海肿瘤中心（FUSCC）队列的四名患者手术期间收集的（图1A）。两名病理学家确认所有淋巴结以证实转移。在对scRNA-seq数据过滤以排除受损或死亡细胞以及doublet后，研究者构建了由65968个单细胞组成的图谱，平均包括1437个质控后的基因。 研究者首先在低分辨率下进行t分布随机近邻嵌入（t-SNE）聚类，在8个样本中识别出15个细胞簇（图1B）。为了识别该图谱的主要细胞类型，研究者基于标记基因的表达水平对细胞簇进行注释（图1C）。细胞被分为八种类型，包括上皮细胞（ECAM1、KRT19、PROM1）、浆细胞（IGHG1、MZB1、SDC1）、髓细胞（CD68、CD163、CSF1R、MRC1、TPSAB1、MS4A2、CD1C）、自然杀伤（NK）细胞（NCR1、GLNY、NKG7）、B细胞（CD79A、CD79B、MS4A1）、T细胞（CD3D、CD3E、CD8A、CD4）、成纤维细胞（COL1A1、COL1A2、DCN）和内皮细胞（PCAM1、VWF）（图1D）。 乳腺癌细胞来源于上皮细胞，因此研究者对上皮细胞进行高分辨率t-SNE，重聚类为11个细胞簇（图2A）。拷贝数变异（CNV）分析已广泛用于scRNA-seq，以探究疾病的演变和发展。研究者对所有上皮细胞CNV水平进行评估，以区分恶性和非恶性细胞（图2B）。淋巴结上皮细胞的CNV水平显著高于原发性肿瘤。在所有上皮细胞簇中，C3相比其他细胞簇，表现出更低的CNV水平（图2B），表明C3是一组正常的乳腺导管上皮细胞，而其他簇是恶性上皮细胞。基于乳腺癌细胞转移过程的CNV变化，研究者为每个患者构建了上皮细胞进化树。所有进化树都显示了从原发肿瘤到淋巴结的相似进化轨迹，表明乳腺癌早期转移过程中，肿瘤进化的共同特征。为了解析乳腺上皮谱系的进化动力学，研究者对11个上皮细胞簇进行了拟时序分析，构建了从非恶性、恶性到转移细胞的四分支轨迹（图2C）。C3位于轨迹曲线的右下角，由于其CNV水平较低，作为该轨迹曲线的起点。该轨迹从初始状态开始，然后分叉为富含转移终点的细胞命运1或细胞命运2分支（图2C）。因此，C2、C4和C9被确定为早期播散性癌细胞（EDC）簇，它们处于轨迹曲线末端，并具有更高的CNV水平（图2B，C）。更重要的是，这三个簇出现在原发性肿瘤和淋巴结中。尽管C8的CNV水平接近正常上皮细胞C3，并且是初始状态的一部分，但由于其在原发性肿瘤和淋巴结中共同存在，因此也被识别为EDC簇。总之，研究者发现C3代表正常的乳腺导管上皮细胞，而C2、C4、C8和C9代表乳腺癌的EDC簇。 图1.乳腺癌原发灶和转移淋巴结中65968个细胞的单细胞表达谱。（A）、本研究设计的图形概述。4名乳腺癌患者肿瘤组织及配对腋窝淋巴结组织制作成单细胞悬浮液，用于10× Genomics的单细胞测序，通过10× Genomics Visium处理肿瘤载玻片，并进行了细胞学实验和IHC染色。（B）、4名乳腺癌患者肿瘤组织及配对腋窝淋巴结组织65968个细胞的t-SNE图，每个子图都分成15个簇，以不同的颜色显示。（C）、65968个细胞的t-SNE图按主要细胞类型着色。（D）、主要细胞类型标记基因表达的气泡图。点的颜色深浅反映表达水平，点的大小表示不同细胞类型中表达标记基因的细胞百分比。
2 OXPHOS和糖酵解的代谢状态转变是EDC细胞簇的关键调节因子 为了研究EDC簇（C2、C4、C8和C9）的基因表达变化，研究者基于MsigDB数据库的Hallmark基因集进行了富集分析，以确定肿瘤细胞在转移过程中的通路变化。最富集的通路包括与细胞增殖相关的通路（mTORC1信号通路，MYC靶点V1）和乳腺癌治疗反应相关的通路（雌激素反应早期，雌激素反应晚期）（图2D），与EDC簇的恶性特征以及患者的临床病理特征相关。有趣的是，EDC簇显示出显著的OXPHOS通路富集，说明这些播散的肿瘤细胞的代谢特征发生变化（图2D）。但是，当对每个EDC簇单独分析时，C4簇没有显示出OXPHOS通路的显著富集，尽管调整后的p值接近0.05。 热图展示了细胞从初始状态变化到细胞命运1或2的基因表达变化，并识别出三种不同的转化模式（图2E）。Davis等人先前的工作强调了OXPHOS通路在乳腺癌转移中的重要性，糖酵解转换到OXPHOS会促进肿瘤转移（特别是定植过程）。同样的，研究者通过拟时序分析也观察到了这种代谢转换。OXPHOS中的标记基因（细胞色素C氧化酶亚基6C[COX6C]、脱氢酶/还原酶2[DHRS2]、ATP5MC2和NDUFB4）表现出先上调后下调的表达模式，而糖酵解通路中的标志基因（GAPDH、LDHA、PKM和PGK1）在恶性上皮细胞的早期转移过程中表现出先降后升的表达模式。同时，与细胞粘附和迁移相关的基因（CLDN3，F11R）也呈现出先下调后上调的表达模式，这些数据表明在转移过程中细胞行为的动态变化（图2F）。研究者提出了一个假设，在转移过程中，乳腺癌细胞的这种代谢转换，类似于上皮-间质转化（EMT）。也就是说，在从原发性肿瘤脱离后，EDC的代谢谱从糖酵解转变为OXPHOS。一旦播散细胞定植，代谢偏好就会恢复到促进细胞增殖的状态。总之，研究者的发现揭示了OXPHOS和糖酵解在乳腺癌早期扩散过程中的转变，表明OXPHOS可能在转移过程中发挥重要作用。 3 TME中EDC细胞簇与免疫细胞的相互作用 为了确定TME中EDC和免疫细胞之间的潜在相互作用，研究者使用CellChat分析以获取细胞-细胞通信。尽管在原发性肿瘤中，主要细胞类型之间的相互作用数量较高，但两组之间相互作用的强度非常接近（图3A）。EDC簇在原发性肿瘤中显示出与免疫细胞更多数量的相互作用，而在淋巴结中显示出更强信号的免疫细胞相互作用（图3B-E）。 研究者分析了不同细胞簇之间的特异性配体-受体相互作用。与原发性肿瘤相比，免疫细胞（CD22-PTPRC、PTPRC-CD22和ADGRE5-CD55）中的配体-受体对在淋巴结中显著上调，这表明这些通路对肿瘤的免疫应答至关重要（图3F）。在原发性肿瘤和淋巴结中，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）通路在EDC和免疫细胞之间都是活跃的，表明其在两个部位都是必需的，并可能有助于乳腺癌的转移（图3F-H）。研究者还计算了淋巴结和原发性肿瘤之间的信息流，用于表示网络中所有成对细胞群之间的总体通讯概率。结果发现，20条通路中有4条在原发性肿瘤和淋巴结中都高度活跃，尽管水平不同（图3I）。这些通路可能是上皮细胞和免疫细胞之间独立于TME的主要信号通路。此外，研究者还在淋巴结中发现了5条特别活跃的通路，而涉及凋亡、细胞迁移和增殖的11条通路（如JAM、APP、CDH、NECTIN和MK）在原发性肿瘤中更活跃（图3I）。总之，CellChat分析表明，TME中的细胞间相互作用在乳腺癌的早期转移中形成。
4 空间转录组结合scRNA-Seq揭示EDC细胞簇的空间特征 为了进一步评估上皮细胞的空间分布，研究者基于4名患者的新鲜肿瘤样本中制作了组织冷冻切片。在H&E染色和明场成像后，研究者将切片注释为三个主要区域，包括肿瘤区域、导管上皮和基质区域（图4A）。然后，研究者进行了空间转录组（ST）分析。研究者共获得了11137个spot，平均深度为8373个UMIs/spot和3167个基因/spot。为了描述原发性肿瘤中主要细胞类型的空间特征，研究者使用SPOTlight将scRNA数据映射到ST切片中。正如预期，基质区域富含内皮细胞，而肿瘤区域富含上皮细胞（图4A），T细胞明显沿着间质区和肿瘤区的边界聚集，表明了乳腺癌原发性肿瘤中TME的独特空间景观。 为了探究EDC簇的空间特征，研究者对ST数据进行了t-SNE分析，将所有的spot聚成15个簇（图4B）。通过将所有ST簇投影到冰冻切片上，研究者观察到明显的分布模式，与H&E染色下的组织学注释一致（图4A）。对于每个样本，肿瘤区域由不同的簇组成，包括T1的CII、T2的CX和CXIV、T3的CIX和CXIII、和T4的CVIII和CXV，表明了四名患者的肿瘤间异质性。为了精确定位上皮细胞，研究者使用MIA分析了上皮细胞簇和ST簇之间的对应关系。研究者发现EDC簇（C2、C4、C8和C9）在肿瘤区域富集（图4A，C）。有趣的是，研究者注意到EDC簇C2和C8在T3和T4中主要位于肿瘤区域的边界，而C6在T3中被C8包围。结合拟时序分析的结果，研究者推测，从恶性阶段（C6）到播散阶段（C8）的演变，与从肿瘤内部到边缘并最终到达转移部位的“通路”是平行的。 为了验证这一假设，研究者手动选择了每个样本的肿瘤边界spot，并基于EDC簇和其他上皮簇之间的差异表达基因特征，开发了乳腺转移特征（BMS）评分。在前65个基因中，26个在转移细胞中表达上调。正如预期，这些基因与细胞迁移和细胞增殖（HSPB1、CRIP1和XBP1）相关，表明EDC簇更为恶性的生物学特征。其中，OXPHOS通路中多个基因（COX6C、DHRS2和NDUFC2）的表达在EDC簇中也显著改变。研究者还计算了每个样本肿瘤边界的OXPHOS评分和EMT评分，评分与肿瘤转移相关。尽管四个样本中三种评分结果不同，但每个样本中肿瘤边界的BMS评分、OXPHOS评分和EMT评分明显高于肿瘤内部区域（图4D，E）。这些结果表明EDC簇主要沿着肿瘤边界分布，这与MIA分析的结果以及scRNA-seq鉴定的EDC簇的代谢特征一致。 为了进一步研究肿瘤边缘的EDC，研究者对T3和T4的ST数据进行了基于图的t-SNE分析，并分别重聚类为9个簇和5个簇（图4F）。BMS评分最高的两个簇（T3中的c2，T4中的c4）沿着样本的肿瘤边界分布（图4F、4G）。根据scRNA-seq的结果，COX6C和DHRS2是EDC簇和其他上皮簇之间的top25差异基因，它们都参与OXPHOS通路，并且高表达COX6C和DHRS2的两个簇都分布在肿瘤边界，这与MIA的结果一致。 研究者还进行了基因集变异分析（GSVA），以研究沿着肿瘤边界的spot和肿瘤区域中的其他spot之间的差异通路。结果表明，OXPHOS通路在沿着肿瘤边界的spot中显著上调。此外，DNA修复、MYC targets V1和mTORC1信号也在EDC簇中显著上调（图4H）。 总之，研究者发现EDC簇倾向于沿着肿瘤边界分布，并表现出OXPHOS上调的代谢特征，说明OXPHOS可能在EDC簇的代谢转变中发挥重要作用。
5 敲低COX6C和DHRS2抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和EMT 为了评估COX6C和DHRS2在乳腺癌细胞中的作用，研究者利用shRNA构建了低表达COX6C或DHRS2的T-47D、MDA-MB-231和MCF-7细胞系。COX6C和DHRS2的下调显著抑制了乳腺癌细胞的增殖（图5A）。在细胞迁移实验中，转染shIL4I1的细胞，其迁移活动显著减少了60%或更多（图5B），说明高水平的COX6C和DHRS2可以促进乳腺癌的侵袭。研究者接着对淋巴结、淋巴结转移阳性或阴性的原发性肿瘤，进行了免疫组化（IHC）染色。研究者发现，在有淋巴结转移的样本中，都检测到COX6C和DHRS2的阳性表达（图5C），Fisher精确检验显示COX6C和DHRS2的表达与淋巴结转移显著相关。有趣的是，在COX6C敲低（shCOX6C）和DHRS2敲低（shDHRS2）细胞中，E-cadherin的表达升高，而Snail表达降低（图5D），说明COX6C和DHRS2可能通过上调EMT相关通路促进细胞迁移。此外，在shCOX6C和shDHRS2细胞中，β-Catenin的表达更低，说明WNT信号通路发生下调。同时，基于scRNA-seq数据集的分析结果也显示了COX6C、DHRS2和EMT通路之间的正相关性（图5E，F）。总之，这些数据表明COX6C和DHRS2的下调可能抑制乳腺癌的细胞增殖、迁移和EMT过程。
6 OXPHOS的上调与乳腺癌患者淋巴结状态和预后具有关联 为了验证OXPHOS通路与乳腺癌早期转移的相关性，研究者在FUSCC队列中应用了单样本基因集富集分析（ssGSEA），并在TCGA和METABRIC数据集的部分样本中进行了GSVA分析。与无淋巴结转移的患者相比，淋巴结转移患者在OXPHOS通路中的得分显著更高，而糖酵解通路的分数更低（图6A-C），这表明OXPHOS的上调可能与淋巴结转移有关，并且可能发生从糖酵解到OXPHO的代谢转换。 为了在外部数据集中验证研究者的发现，研究者选择了GSE167036数据集作为外部验证集，包括8对原发性乳腺肿瘤组织和转移性腋窝淋巴结的scRNA-seq数据。研究者进行了低分辨率的均匀流形近似和投影（UMAP）聚类，并识别了肿瘤上皮细胞。在基于标记基因的细胞注释后（图6D），研究者进行了KEGG富集分析，以确定淋巴结的肿瘤上皮细胞显著富集的通路。正如预期，OXPHOS、雌激素信号和紧密连接通路在EDC细胞中富集（图6E），这与研究者的结果一致（图2D）。此外，COX6C的上调与基底样乳腺癌较差的总体生存率（OS）相关，而与HER2阳性乳腺癌的较差的OS以及较差的无远处转移生存率（DMFS）相关。DHRS2的上调与基底样乳腺癌中较差的OS以及DMFS相关（图6F，G）。总之，这些结果表明，OXPHOS通路在预测乳腺癌淋巴转移风险和预后方面具有重要价值。
讨论 在本研究中，研究者基于乳腺癌患者及配对的转移腋窝淋巴结组织进行scRNA-seq，识别出一种播散性肿瘤细胞簇。通过整合scRNA-seq和ST技术，研究者从空间和时间两个层面对EDC细胞簇进行表征。在乳腺癌早期转移的演变过程中，EDC簇从糖酵解向OXPHOS转变，并具有沿着肿瘤边界分布的倾向。先前的研究使用scRNA-seq探究乳腺癌患者来源异种移植模型中的能量合成代谢转变，研究者描述播散肿瘤细胞定植后的生物能量状态，使这一发现更加深入。此外，研究者是基于乳腺癌原发灶和转移性淋巴结的配对临床样本进行的测序，因此更具有临床相关性。 肿瘤细胞经历一系列进化过程，成为播散性恶性细胞。该过程在遗传、表观遗传和转录组多个层面发生改变，使恶性细胞更具侵袭性。恶性细胞具有基因组不稳定性、细胞死亡抗性和代谢改变等特征，从而进一步获得了运动性、侵袭性、可塑性，在经历微环境调节和EMT后，发展为播散性肿瘤细胞，并最终在远端定植。测序技术的快速发展使研究者更深入地了解这一过程中的转变。本研究主要关注乳腺癌早期的播散性细胞代谢演变。肿瘤细胞的代谢变化在调节肿瘤转移中起着重要作用。OXPHOS和糖酵解在肿瘤转移中的作用仍有争议，在乳腺癌小鼠模型中，循环肿瘤细胞的OXPHOS激活，过氧化物酶体增殖物激活受体γ和辅激活因子1α（PGC-1α）通过增强该通路促进远处转移。OXPHOS促进了细胞侵袭，可能与线粒体过度代谢导致的超氧化物增加有关。然而，有研究发现OXPHOS与EMT呈负相关，在高存活率的患者中该通路中的基因下调。通过抑制糖酵解的关键酶LDHA，可以抑制多种癌症的肿瘤迁移。结果的争议可能是由于转移过程中的代谢变化是动态的，OXPHOS和糖酵解的水平波动会影响结果的一致性。本研究表明，OXPHOS的上调在肿瘤转移过程中是暂时性的，一旦发生定植，播散性肿瘤细胞会表现出糖酵解上调的恶性特征。 本研究发现EDC细胞簇主要位于肿瘤的边界，换句话说，早期转移的肿瘤细胞沿着肿瘤-宿主边界分布。肿瘤宿主微环境使肿瘤细胞和间充质基质成分之间发生广泛的细胞通讯。在鳞状细胞癌中，位于肿瘤边界的恶性细胞，与多种细胞类型相互作用，表现出侵袭性表型。细胞相互作用在乳腺癌中也至关重要。成纤维细胞和免疫细胞等邻近的细胞与转移相关。在本研究中，研究者使用CellChat分析，确定MIF通路在播散性肿瘤细胞和免疫细胞中高度激活。MIF是一种与CD74/CD44、CXCR2、CXCR4和CXCR7受体结合和激活的细胞因子，在恶性疾病中发挥重要作用，并可能是治疗三阴性乳腺癌的新靶点。这需要进一步研究以阐明MIF与转移之间的关系。 本研究具有以下局限性。首先是样本之间的高度空间异质性，这使得发现共有特征十分困难。第二是样本数量有限。研究者对四名患者进行了scRNA-seq和ST，限制了研究者结论的推广。Liu等人使用scRNA-seq表征了原发性肿瘤和配对转移淋巴结的微环境。研究者将他们的数据集作为外部验证集，以进一步确认转移肿瘤细胞的代谢特征。 研究者使用了两种方法结合scRNA-seq和ST，以使结果更令人信服。此外，早期转移可以通过血行通路或淋巴通路发生。但是，血行转移的早期检测困难且不稳定，所以研究者只关注淋巴通路的转移，后续研究需要对早期血行转移进行进一步表征。 总之，本研究的结果揭示了乳腺癌中播散细胞的代谢变化，以及早期转移过程中的动态演变。研究者的结果需要对乳腺癌早期转移机制进行进一步研究，具有潜在的预后和治疗价值。 |
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