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题目：Overexpression of HvAKT1 improves drought tolerance in barley by regulating root ion homeostasis and ROS and NO signaling 刊名：Journal of Experimental Botany 作者：Zhong-Hua Chen, Feibo Wu et al. 单位：Jiangsu Normal University, Xuzhou 日期：31 October 2022    01 摘要  钾 (K + ) 是植物中用于渗透压调节、细胞生长和酶激活的主要阳离子无机营养素。内向整流 K+通道 1 (AKT1) 是植物根部吸收 K+的主要通道，但 HvAKT1 在干旱胁迫下大麦植物中的功能尚未完全阐明。 在这项研究中，我们进行了进化生物信息学、生物技术、电生理学和生化分析，以探索 HvAKT1 响应大麦干旱的分子机制。XZ5（一种耐旱野生大麦基因型）根部的干旱胁迫显着上调了HvAKT1的表达。 分离质膜定位的 HvAKT1 并对其进行功能表征，农杆菌介导的植物转化和大麦条纹花叶病毒诱导的大麦HvAKT1基因沉默。进化生物信息学表明，AKT1 中的 K +选择性过滤器起源于链生藻类，在陆地植物中进化保守。HvAKT1的沉默导致生物量显着减少，并抑制干旱处理下根表皮细胞对K + 的吸收。 破坏HvAKT1会降低根部 H +外排、H + -ATP 酶活性和一氧化氮 (NO) 合成，但会增加过氧化氢 (H 2 O 2) 在干旱胁迫下根部的生产。 此外，我们观察到HvAKT1的过表达提高了 K +的吸收并增强了大麦的抗旱性。我们的研究结果强调了 HvAKT1 对根系 K +吸收的重要性及其对根系 H + -ATPase、H 2 O 2和 NO 响应干旱胁迫的多效性影响，为在大麦中耐旱性和 K +营养的遗传基础提供了新的见解。 02 技术路线  抗旱西藏野生大麦 XZ5, 一株抗旱品种 Tadmor, 一株敏感干旱品种 ZJU9, Golden promise (WT)，并且在本研究中使用过表达线。 进化生物信息学分析 分子生物学分析 电生理学分析 电生理学 生化测量 03 主要结果 3.1 AKT1 是从链藻藻类进化而来的，用于吸收钾 我们使用生物信息学和进化工具来评估植物和藻类物种中的 AKT1（图 1 )。氨基酸序列分析表明，HvAKT1 具有四个功能域：ion-trans-2、cNMP、ANKi 和 KHA（图 1A）。使用千种植物转录组数据库的进化分析表明，1322 种植物和藻类中有 76% 预测了 AKT1 的蛋白质序列。此外，AKT1 中的 K +选择性过滤器 TxxTxGYGD 源自链藻（图 1C）。蛋白质比对和蛋白质拓扑结构预测表明，AKT1 在被子植物、裸子植物、蕨类植物、石松植物、苔藓、苔类植物和链生藻类的代表性物种中高度保守（图 1D）。然而，与链藻和陆生植物相比，叶绿藻中推定的 AKT1 在序列和结构上表现出显着差异（图 1)，暗示 AKT1 可能从链藻藻类进化而来。
3.2 质膜 K +通道 HvAKT1 赋予大麦根耐旱性 我们接下来对大麦基因型 XZ5 中的HvAKT1表达水平进行了组织特异性分析。结果表明，HvAKT1主要在根中表达（图2A）。与对照相比，在 24 小时 PEG 诱导的干旱处理中，XZ5 中根中的HvAKT1表达显着上调 7.3 倍，但在干旱敏感的 ZJU9 中显着下调，而在 Tadmor 中则没有变化（图 2B ）). 为了确定 HvAKT1 的亚细胞定位，使用 sGFP 融合构建体在洋葱表皮细胞和大麦根原生质体中进行了由 35S 启动子驱动的瞬时表达测定。结果显示，GFP荧光与红色荧光蛋白（RFP）荧光重叠，表明HvAKT1蛋白定位于质膜（PM）（图2C、D）。
我们进行了一系列实验来分析 HvAKT1 在耐旱性中的潜在作用。基因沉默效率测试表明，与模拟接种的植物相比，BSMV：HvAKT1接种的幼苗在对照条件下根部 HvAKT1 的转录物沉默了 83％，在干旱条件下沉默了 86％（图 3 ). 与 XZ5 的模拟接种幼苗相比，PEG 处理导致 BSMV:HvAKT1 接种植物的生长显着减少和叶片萎蔫（图 3A）。在 BSMV:HvAKT1 接种的幼苗中，干旱处理下生物量显着减少 63%，而模拟接种植物的生物量减少 36%（图 3C ）。钾+在 PEG 诱导的干旱处理下，模拟接种幼苗根部浓度明显增加 26%，但 BSMV:HvAKT1 接种植物根部浓度显着降低 31%（图 3D ）。
验证了四个独立的转基因 HvAKT1-OX 品系具有显着的HvAKT1上调（补充图 S4 )。HvAKT1的表达在 HvAKT1-OX1 转基因品系中上调了 3.1 倍，该转基因品系被选择用于进一步的实验（图 4B）。与 WT Golden Promise 相比，HvAKT1-OX 植物中干旱诱导的叶片萎蔫和生长抑制明显更少（图 4A）。例如，与对照相比，干旱条件下 WT 的生物量显着降低了 45%，而 HvAKT1-OX 植物的生物量降低了 15%（图4C）。K +浓度在经过 PEG 处理的 WT 根中降低了 17%，但在 HvAKT1-OX 植物的根中显着增加了 27%（图 4D）。
3.3 HvAKT1 调节野生大麦耐旱性的K +和 H +稳态 然后我们进行了实验来破译大麦耐旱性的功能性 HvAKT1（图 5-7）。PEG 处理导致根部成熟区 K +大量流入，随后缓慢恢复至稳态水平，但 K +流入在模拟接种植物中维持在显着更高的水平。有趣的是，在 BSMV:HvAKT1 接种的植物中，几乎没有 PEG 诱导的瞬时K +摄取，随后是–55 nmol m –2 s –1的净 K +流出：HvAKT1 接种植物，而峰值 PEG 诱导的 K +模拟接种植物中的流入量为 514 nmol m –2 s –1 （图 5A). PEG 处理在模拟接种植物中暴露后 1 小时引起显着的 K +流入，而 HvAKT1 沉默植物没有显着增加。在所有接种植物中暴露于 PEG 12 小时后，干旱诱导的 K +内流进一步增加。在 BSMV:HvAKT1 接种的植物中，根部 K +流入转变为流出，但在 PEG 处理 24 小时后模拟接种植物中的50 nmol m –2 s –1 K +流入仍保持在显着更高的水平 ( P <0.05)曝光（图5B）。此外，干旱胁迫导致根 K +流入 HvAKT1-OX 植物，随后缓慢恢复到稳态水平。由 PEG 引起的 HvAKT1-OX 植物中的峰值 K +流入比 WT 中的峰值高 2.0 倍（图 5C）。与 WT 植物相比，PEG 处理在暴露 1 小时后在 HvAKT1-OX 品系中引起显着更大的 K +流入 ( P <0.05)。在所有植物中，K +流入在 PEG 暴露 24 小时后进一步减少，但在 HvAKT1-OX 植物中保持在 70–80 nmol m –2 s –1 （图 5D）。
PEG 在所有接种植物中导致 H +流出，模拟和 BSMV:HvAKT1 接种植物根部 H +流出的最大差异为~2 倍（图 6A）。在 PEG 暴露 1 小时后， H +通量在根成熟区从流入转变为流出，但BSMV:HvAKT1 接种植物在 PEG 暴露 24 小时后H +流入除外（图 6B）。此外，PEG 处理 5 天后，模拟接种植物根部的 H + -ATPase活性显着增加了 67%，而BSMV:HvAKT1- 根部的H + -ATPase 活性降低了 45%。接种植物（图6C). PEG 处理后 HvAKT1-OX 植物根中 H + -ATPase的活性显着增加了 63%，而 WT 的根中仅略有增加（图 6D）。
3.4 沉默HvAKT1影响大麦中的NO 和 H 2 O 2信号 与对照相比，PEG 处理导致模拟接种植物根部的 NO 含量增加 39%。相反，BSMV:HvAKT1 接种植物的根中 NO 含量降低（图 7B）。使用 DAF-2DA 荧光染料通过共聚焦显微镜验证 NO 改变。因此，PEG 处理显着降低了 BSMV:HvAKT1 接种植物根部成熟区中的 NO，而 XZ5 中的 NO 未显示显着增加（图 7D，E）。SNP 的添加显着减轻了干旱处理后 BSMV:HvAKT1 接种植物的损害（图 7A）。 干旱胁迫显着提高了所有植物中的 H 2 O 2含量，其中 BSMV:HvAKT1 接种植物的提高更大（图 7C）。例如，在 BSMV:HvAKT1 接种的幼苗和模拟接种的植物之间检测到干旱诱导的 H 2 O 2含量有 4.2 倍的差异。H 2 O 2的产生也通过使用H 2 DCFDA 染料的共聚焦显微镜来验证。在XZ5 的根表皮中，PEG 暴露导致根成熟区H 2 O 2含量略有升高，但在BSMV:HvAKT1 接种的植物中PEG 处理1 h 后H 2 O 2 含量明显下降。然而，H与对照相比，BSMV:HvAKT1 接种植物中的2 O 2含量增加（图 7F、J）。外源 DMTU 减少了 BSMV:HvAKT1 接种植物在干旱胁迫下的氧化损伤症状（图 7A）。
 04 结论 在这项研究中，我们在过表达和沉默的大麦品系中分离并功能表征了 HvAKT1。我们的结果表明，沉默HvAKT1会导致干旱处理下根表皮细胞的生物量显着减少，抑制 K +吸收，并减少 K +流入。HvAKT1的过表达通过对各种目标（例如 H + -ATP 酶、NO 和 H 2 O 2产生以及离子通量）的一系列信号传导功能提高大麦的耐旱性。我们的结果强调了 HvAKT1 对 K +的重要性吸收以应对干旱胁迫，并证明了钾营养在适应包括干旱在内的环境胁迫中的重要作用。 05 原文获取 原文链接： https://academic./jxb/article/71/20/6587/5885071 PDF获取： https://www./h-nd-168.html |
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